Transfer-messenger RNA (tmRNA) combines the dual functions of tRNA and mRNA. It rescues stalled ribosomes caused by defective mRNAs in bacteria cells, via the trans-translation process. Trans-translation is initiated by the alanyl-tmRNA entry into the A site of the ribosome. SmpB is a tmRNA-specific binding protein and enhances the alanylation efficiency of tmRNA and facilitates tmRNA entry into the ribosome. There is no codon-anticodon reaction in trans-translation and Studies demonstrate that SmpB that binds to the A site on the 30S subunit and mimics an anticodon arm of tRNA plays a crucial role for the "decoding" process of tmRNA.

SmpB has a 30-residues C-tail with random structure. The c-tail of SmpB is near the decoding center in trans-translation. Although many studies demonstrate that mutations of aresidues on c-tail severely damage the function of SmpB, it still remains unclear how SmpB compensates for the role of the anticodon of tRNA and how the c-tail of SmpB interacting with ribosome in trans-translation. Here we studied the interaction of tmRNA/SmpB complex and ribosome using biochemical methods and biophysical techniques like single-molecule imaging. The movement of tmRNA/SmpB complex on ribosome can be traced in real time.

Results:

1 SmpB stimulates GTP hydrolysis and only one SmpB molecule is needed in trans-translation for one 70s ribosome

SmpB is also essential for the GTP hydrolysis by EF-Tu on a ribosome. In the presence of limited concentration of a ribosome, the increase of a GTP hydrolysis rate was linearly dependent upon the ribosome concentration. The turnover rates were calculated as 2.4 s-1 in the case of tmRNA and 5.3 s-1 in the case of TLD, respectively. These values are in same order of magnitude as compared to the case of that carried out by a ribosome and EF-G (reported as 4.3 s-1 by Seo et al.19).

Fixed the SmpB concentration at 0.125mM, which was not saturating, and addressed the effect of tmRNA or TLD concentration on the GTP hydrolysis rate. In the case of TLD, the GTP hydrolysis rate was increased in proportion to the TLD concentration and was saturated when the concentration reached equivalent to SmpB. In the case of tmRNA, GTP hydrolysis was also increased in proportion to tmRNA concentration and was nearly saturated when the concentration reached equivalent to SmpB. These results suggested that only one molecule of SmpB is necessary for the GTP hydrolysis per one 70S ribosome.

2 The C-tail mutants of SmpB cannot support the alanyl-tmRNA accommodation into the A site of the ribosome

The residues on the disorder c-terminus tail of SmpB were conserved. SmpB153 that lacks C-terminal seven amino acids residues is reported incapable of facilitating TLD-derived template-independent polyalanine synthesis. We prepared a series of truncated variants that lack C-tail residues stepwisely (SmpB153, SmpB149, SmpB139, SmpB136, SmpB130) and introduced single or double alanine substitutions to the residues of D137, K138 and R139. All the variants possessed the alanylation enhancing activity and indicate that the residues in the C-terminal region of SmpB are not involved in the enhancement of alanylation nor binding to the TLD.

The series of truncated SmpB variants (SmpB153, SmpB149, SmpB139) and SmpBDE could not support the attachment of SsrA tag to the DHFR while the single mutants (R139A, K138A, and D137A) or double mutants (R139A/K138A, R139A/D137A, K138A/D137A) did. The results strongly indicate that the trans-translation deficient SmpB mutants cannot facilitate tmRNA accommodation in the A site of the ribosome

3 Trans-translaiton deficient SmpB still triggers GTP hydrolysis of EF-Tu

Using the series of mutant SmpB, GTPase stimulating activity was monitored. Interestingly, all of the prepared mutants still triggered GTP hydrolysis of EF-Tu. The decrease of GTPase stimulating activity correlated with the numbers of deleted C-tail residues, suggesting large part of the C-tail region of SmpB is involved in the GTPase stimulation. The mutation of D137 and R139 also reduced the rate of GTP hydrolysis, suggesting these residues are also involved in the GTPase stimulation.

4 PMB80 can block the non-specific binding of SmpB

Single-molecule imaging can follow the movement of tmRNA/SmpB movement on ribosome in real time. But the non-specific binding of SmpB is a main barrier. 0.1% of PMB80 can block the non-specific binding of SmpB. Omission of EF-Tu and AlaRS strengthened the non-specific binding of SmpB and cannot be the control of the experiment.

Conclusion

SmpB binds on the tRNA-like domain of tmRNA and compensates for the lack of codon-anticodon of trans-translation. Although studies suggest that two molecules of SmpB bind to both subunits and necessary for the trans-translation in bulk, in the present study, the results suggest that only one molecule of SmpB is necessary to cause the structural rearrangement of the ribosome to trigger GTP hydrolysis of EF-Tu. The removal of the C-tail region of SmpB results as trans-translation deficient SmpB but still stimulates the GTP hydrolysis of EF-Tu, suggesting that the C-tail of SmpB is essential for the alanyl-tmRNA accommodation but not for the stimulation of GTP hydrolysis. Non-specific binding of SmpB to the glass seemed to be blocked by 0.1% of PMB80. The interaction of SmpB and ribosome may be elucidated in detail and in real time using single-molecule imaging.

Figure 1. Kinetic studies of GTPase stimulation activity of SmpB

Figure 2. Aminoacylation efficiency of SmpB variants

Figure 3. SsrA tagging supporting activity of SmpB variants.

Figure 4. Activities of SmpB variants on the GTP hydrolysis stimulation by EF-Tu on the ribosome

Figure 5. Block of non-specific binding of SmpB by PMB80

本論文は大腸菌における新生ペプチド品質管理の一端を担うtrans-translation機構に関する研究の成果をまとめたものである。この機構には、tmRNAという特殊なRNA(1分子でtRNAとmRNAの両方の性質を持つ)と、SmpB蛋白質のRNA-蛋白質複合体(RNP)が関与する。そして、途中で切断されたmRNAの翻訳等によって生じた"翻訳途中で異常停止したリボソーム-mRNA-新生ペプチド複合体"を解離させつつ、できそこないの新生ペプチドに分解用シグナルペプチドを付加する事で、新生ペプチドの品質管理に関わる仕組みであり、その解明は、ヒトを含めた他の生物種でも報告されている同様の品質管理機構の解明にも役立つと期待される。

第一章では、研究の背景が述べられている。trans-translationの特徴の一つは、tmRNA-SmpB複合体が異常停止リボソームに結合する際にリボソームAサイトのmRNAのコドン依存性がない事である。tmRNAのTLD(tRNA like domain)部分はアラニンtRNAに構造が似ているものの、コドン認識部位(アンチコドン アーム)を欠いている。一方、tmRNA-SmpB複合体のAサイトへの結合によってtrans-translationの各反応が開始される事から、tmRNA-SmpB複合体の結合は何らかの方法でリボソームの小サブユニットにも認識されるはずである。従来の構造解析の結果、SmpBがtRNAのアンチコドン アーム構造を擬態しており、また、生化学的解析の結果、SmpBのC末端が認識に寄与している事がわかってきている。しかし、複数ある認識段階に対して、SmpBのC末端のどの部位がどの段階に寄与しているのかは未解明であった。また、従来は複数ある反応段階を詳細に調べる手法がなく、その理解が限られていた。本章では、このような背景と結果の概要が述べられている。

第二章では、実験手法が述べられている。

第三章から第六章にかけては、tmRNA-SmpB複合体の異常停止リボソームへの結合に際して、SmpBのC末端がどのように寄与しているのかが述べられている。SmpBは160アミノ酸からなる蛋白質で、そのC末端(30アミノ酸)は特定の構造はとっておらず、天然変性状態にあると報告されている。このC末端の寄与を明らかにするために、一連の欠失変異体(SmpB130-SmpB153) 、及び、機能に重要であると報告されているD137, K138, R139の1つまたは2つをアラニンに置換した変異体が解析された。その結果、C末端の特定の部分ではなく広範な部分が、結合認識に寄与している事が示された。

第七章では、反応段階を詳細に調べられる蛍光一分子観察法を用いて、ガラス上に固定化したリボソームと蛍光標識tmRNA-SmpB複合体間の相互作用解析が述べられている。まず、リボソームを安定的かつ簡単に標識する新規手法を開発した。具体的には、リボソームの小サブユニットのS2蛋白質にHaloTag蛋白質(297アミノ酸)を融合させた変異リボソームを用い、HaloTag蛋白質に特異的に共有結合するHaloTagリガンドを介して蛍光標識、及び、固定用のbiotin標識を行った。この標識リボソーム(Cy3-biotin リボソーム)は蛋白質翻訳能を有しており(野生型の70%)、また、SsrAタグ化反応も起こる事から、活性に問題がないことが示された。一方、tmRNAも複数の標識法を比較検討し、活性に影響がない蛍光標識法を見出した。更に、観察ガラスの表面処理方法にも独自の工夫を加え、非特異結合を防いだ。その結果、1分子のリボソームに1分子のtmRNA-SmpB複合体が相互作用する様子をリアルタイムに観察するのに成功した。この実験系を用いて、まずは単純な反応を解析した。mRNAも新生ペプチドも保持していない"空のリボソーム"にtmRNA-SmpB複合体が相互作用する様子を観察し、個々の相互作用を解析・統計処理した結果、tmRNA-SmpB複合体がリボソームに結合してから解離するまでには少なくとも2つの経路がある事がわかった。これは、tmRNAのTLD部分のみからなる変異体を用いても観察されたことから、tmRNAの特徴的な構造部分(mRNA Like domain (MLD)や4つのpseudoknots)が原因ではなく、TLD部分の認識に起因する事が示唆された。このように本研究で立ち上げた実験系は、trans-translation機構の詳細な解明に寄与すると期待される。また、本研究で開発されたリボソームの新規標識方法は、細胞内での観察も含めて広く応用が可能であり、評価に値する。

よって、博士(生命科学)の学位を授与できると認める。