TrkB is the Trk family of receptor tyrosine kinases, and a high-affinity receptor for the neurotrophic factor brain-derived neurotrophic factor (BDNF). Neurotrophin signaling through this receptor regulates cell survival, proliferation, the fate of neural precursors, axon and dendrite growth and patterning, and the expression and activity of functionally important proteins, such as ion channels and neurotransmitter receptors. (Bibel et al., 2000; Huang et al., 2003) In the adult nervous system, the BDNF/TrkB signaling regulates synaptic strength, plasticity (Bibel et al., 2000; Huang et al., 2003), and plays an important role in learning and memory (Yamada et al., 2002), and drug addiction (Hall et al., 2003).

Recently, several studies have implicated BDNF/TrkB signaling in mood disorders such as anxiety and depression (Martinowich et al., 2007). Previous studies report that when placed in stressful settings, BDNF(+/-) and BDNF(Met/Met) mice, which impaired BDNF/TrkB signaling in the whole brain, exhibited increased anxiety-like behaviors (Chen et al., 2006). But whether this tendency is persistent in several brain regions including the striatum, which is an important component of the reward system associated with drug addiction, is unclear.

In the striatum, TrkB proteins are not only on the medium spiny neurons (MSNs) (Altar et al., 1998), which are the predominant projection neurons in the striatum, but also on the terminal of dopaminergic neurons projecting to MSNs (Mufson et al., 1994). On the other hand, all of the BDNF in the striatum is present in the terminals of afferent neurons (Altar et al., 1997). The hippocampal, cortical, nigral, amygdala and thalamic neuron groups that project to the striatum contain high levels of BDNF mRNA (Hofer et al., 1990; Seroogy et al., 1993). Thus, both pharmacological technique and conventional knockout should have affected both pre- and postsynaptic BDNF/TrkB signalings equally.

I therefore established striatum-selective TrkB-deficient (mutant) mouse line. The G-protein γ7 subunit mRNA is expressed predominantly in medium spiny neurons of the caudate-putamen (CP) and nucleus accumbens (NAc) and neurons of the olfactory tubercle (Watson et al., 1994). To develop a striatal neuron-selective gene manipulation system, I chose to use the Gng7(Cre) mouse line by inserting the gene encoding Cre recombinase into the translational site of G-protein γ7 subunit gene (Gng7) through homologous recombination in embryonic stem cells derived from the C57BL/6 strain (Mishina and Sakimura, 2007). I crossed the Gng7(Cre) mice with the CAG-CAT-Z11 reporter mouse (Tsujita et al., 1999). Brain slices prepared from Gng7(Cre)×CAG-CAT-Z11 mice were stained for β-galactosidase activity to monitor the Cre recombinase activity. Strong β-galactosidase staining was found predominantly in the CP, NAc and olfactory tubercle.

To obtain Gng7(Cre/+); TrkB(flox/flox) (mutant) and TrkB(flox/flox) (control) mice I then crossed the Gng7(Cre) (Gγ7-cre) mouse with TrkB(flox) mouse line through homologous recombination in embryonic stem cells derived from the C57BL/6 strain (Iwano, 2002).

To investigate whether Cre recombinase-dependent excision affects the expression of TrkB protein, I performed immunoblot analysis on striatal homogenates from control and mutant mice. Immunoblot analysis with anti-pan-TrkB antibody showed that a band at 145 kDa, which corresponds in molecular mass of the full-length TrkB, was decreased to about 50% in mutant mice compared with control mice. It was noticed that, because TrkB are expressed in both striatal medium spiny neurons and neurons projecting to the striatum (Merlio et al., 1992; Altar et al., 1994), TrkB of afferent terminals may be also detected. In situ hybridization analysis using a probe corresponding to the floxed kinase domain in collaboration with Dr. Uchigashima showed that the expression of the TrkB mRNA is diminished selectively in the striatum. Furthermore, quantitative RT-PCR (QRT-PCR) analysis showed an extensive decrease of the TrkB mRNA in the striatum of mutant mice. These results suggest that the expression of the TrkB was almost completely diminished in the striatum of the mutant mice.

During bleeding of the mutant mice, I noted unusual fighting between male control mice and mutant littermates that sometimes resulted in severe injuries. To quantify the frequency of fighting, I performed isolation-induced aggression. In comparison with littermate control mice, mutant mice manifested extensive aggression. These results suggest that the striatal TrkB is involved in the suppression of aggressive behavior.

Since aggression frequently correlates with anxiety (Parmigiani et al., 1998), I suspected that the alteration of anxiety-like behaviors of mutant mice might have contributed to their enhanced aggressive behavior. To examine whether the loss of striatal TrkB was associated with anxiety-like behaviors, I performed the elevated plus-maze. The elevated plus-maze is a standard test to analyze anxiety-like behavior by measuring the avoidance of the unsheltered open arms. In comparison with littermate control mice, mutant mice exhibited a significant increase in the percentage of entries into open arms and the percentage of time spent in open arms. Mutant mice also displayed increased exploratory behavior as demonstrated by a enhanced total arm entries. I also performed the open field test, another standard measure of anxiety-like behavior that place subjects in conflict situations, but there were not significant difference between control and mutant mice in the percentage of time spent in the center square. I further investigated mutant mice in another animal model related to anxiety that is fundamentally different from the conflict model. For this purpose, I chose the marble-burying behavior test (Njung'e and Handley SL, 1991). In this test, as mice that are more anxious must engage in active behaviors (defensive marble burying) as opposed to passive behaviors utilized to avoid anxiogenic stimuli in the elevated plus-maze (Jacobson et al., 2007). In comparison with littermate control mice, mutant mice exhibited a significant decrease in the number of buried marbles. Mutant mice also displayed increased horizontal activity.

Taken together, these findings suggest that the BDNF/TrkB signaling in the striatum is required for the expression of the anxiety-like behaviors.

Given that reduced anxiety-like behaviors and enhanced aggressive behavior in mutant mice can be attributed to either a cognitive dysfunction in which mice could not understand the risk or a lack of proper inhibition of impulsive behaviors, I then performed the cliff-avoidance test (Yoshida et al., 1998; Matsuoka et al., 2005). In this test, control mice placed on an elevated transparent platform (the base of an inverted glass beaker with a height more than twice the mice's body length) avoided the edge and rarely fell. In contrast, nine of nine mutant mice fell from the platform within 10 min, where as three of nine control mice fell within this period. This behavioral abnormality might reflect either cognitive dysfunction or impulsivity.

Mutant mice showed a consistently increase in locomotor activity in several different tests, i.e. elevated plus-maze, open field test and marble-burying behavior test. To confirm these observations, we measured horizontal activity in the home cage for 3 days. Total distance traveled by mutant mice was significantly greater than that of control mice during the dark cycle. These results suggest that TrkB of the striatum is required for the suppressive regulation of the locomotor activity in the novel environment and during the dark cycles.

Medium spiny neurons, which account for over 90% of neurons in the striatum, are divided into two types, which give rise to the two main components of the prototypical basal ganglia circuit, the "direct" and "indirect" striatal projection systems. Most of those neurons projecting to the lateral globus pallidus (LGP) alone (the indirect pathway) contain the neuropeptide enkephalin, whereas most of those which project to the substance nigra (SN) (the direct pathway) contain the neuropeptide sibstance P (Gerfen, 2004). These two neuropeptides are anterogradely transported to the axon terminals in the afferent regions (Drago et al., 1998). As one measure of the functional state of direct and indirect pathway, I performed immunohistochemical staining of a series of coronal section with anti-enkephalin and substance P antibodies. Although immunoreactivities for substance P were comparable between genotypes, immunoreactivities for enkephalin in the LGP of mutant mice were impaired. Consistently, in collaboration with Dr. Uchigashima, the expressions of the enkephalin mRNA were reduced in the striatum of the mutant mice, while those of the substance P mRNA remained intact in the mutant striatum. Furthermore, QRT-PCR analysis showed a decrease in enkephalin mRNA in the striatum of mutant mice but not substance P mRNA. Previous reports showed that mutant mice lacking enkephalin exhibited enhanced aggressive behavior (Konig et al., 1996) and lacking adenosine A2A receptor showed the reduction of the enkephalin mRNA expression and enhanced aggressive behavior (Ledent et al., 1997). Thus, I propose that the ablation of TrkB in the medium spiny neurons of the striatum reduces the expression of enkephalin in the indirect pathway and thus results in the enhancement of the aggressive behavior.

Thus, these results suggest that the BDNF/TrkB signaling in the striatum is required for the suppressive regulation of the locomotor activity and the expression of the anxiety-like behaviors. Furthermore, the striatal TrkB is involved in the suppression of aggressive behavior probably by regulating enkephalinergic projections.

TrkBを介したBDNFシグナリングは、ニューロンの発達、シナプス可塑性、記憶・学習などにとって重要な役割をしているだけでなく、近年、不安障害やうつ病といった情動障害への関与も明らかになってきている。また、線条体は運動の制御、手続き記憶や薬物濫用にとって重要な脳部位であることが知られており、更にはうつ病、強迫性障害、ADHDや統合失調症といった障害への関与も示唆されている。そこで、本研究は線条体におけるBDNF/TrkBシグナリングの役割を明らかにするため、Cre-loxP系を用いた線条体選択的なTrkBノックアウトマウス (変異マウス)の系統を確立し、組織学的解析および行動学的解析を行い、以下の結果を得ている。

1. Medium spiny neuron (MSN)は、線条体のニューロンの90-95%を占める投射ニューロンである。コントロールマウスと変異マウスから得た脳の切片に対しin situ ハイブリダイゼーション解析を行ったところ、変異マウスにおいて、MSN選択的なTrkB mRNAのシグナルの消失が観察された。この観察結果を定量化するため、コントロールマウスと変異マウスの線条体をホモジナイズして得た試料に対し定量PCR解析を行ったところ、変異マウスではコントロールマウスに比べ、TrkB mRNAが量的に顕著に減少していた。また、TrkBのタンパク質量を定量化するため、コントロールマウスと変異マウスの線条体をホモジナイズして得た試料に対しイムノブロット解析を行ったところ、変異マウスではコントロールマウスに比べ、TrkBタンパク質の量が約50%まで減少していた。変異マウスの線条体MSN (ポストシナプス)ではTrkB mRNAが顕著に消失していることから、この残留しているTrkBタンパク質はMSNに投射しているニューロンの終末 (プレシナプス)に存在するTrkBのものと考えられる。以上のことから、線条体のプレシナプスのTrkBは残したまま、ポストシナプスであるMSNにおけるTrkBの役割を解析することが可能な変異マウスの系統が確立出来たと言える。

2. 線条体のMSNは、dopamine D1 receptor (D1R), substance P, muscarinic acetylcholine receptor 4 (mAChR M4)を特異的に発現している直接経路のニューロンと、dopamine D2 receptor (D2R), enkephalin, adenosine A2A receptor (A2AR)を特異的に発現している間接経路のニューロンに大別される。コントロールマウスと変異マウスから得た脳の切片に対しin situ ハイブリダイゼーション解析行ったところ、変異マウスの線条体でenkephalin mRNAのシグナルの減少が確認された。これに対し、D1R, substance P, mAChR M4, D2R, A2AR mRNAのシグナルは、コントロールマウスと変異マウスの間に顕著な違いが観察されなかった。この結果を定量化するため、コントロールマウスと変異マウスの線条体をホモジナイズして得た試料に対し定量PCR解析を行ったところ、コントロールマウスに比べ、変異マウスではenkephalin mRNAが量的に顕著な減少を示したのに対し、substance P mRNAについてはコントロールマウスと変異マウスとの間に顕著な差はみられなかった。また、コントロールマウスと変異マウスから得た脳の切片に対して免疫染色解析を行ったところ、コントロールマウスに比べ、変異マウスでは間接経路を構成するMSNの投射先である淡蒼球外側においてenkephalinのシグナルの減少が観察されたのに対し、直接経路を構成するMSNの投射先である黒質においてはsubstance Pのシグナルにコントロールマウスと変異マウスで顕著な違いが観察されなかった。これらのことは、線条体TrkBが間接経路におけるenkephalinの発現の制御に関わっていることを示している。

3. 変異マウスとコントロールマウスが同一ケージで飼育されている場合にのみ、1割程度の頻度で背中に重度の傷を負ったマウスが観察されたことから、変異マウスにおける攻撃性の亢進の可能性が考えられた。そこで、攻撃行動を定量化するため、コントロールマウスと変異マウスに対しisolation-induced aggressionを行ったところ、コントロールマウスに比べ、変異マウスは攻撃行動の頻度が顕著に高いことが明らかになった。このことは、線条体TrkBが攻撃行動の抑制に重要であることを示している。

また、先行論文によりenkephalinの減少が攻撃行動を亢進させることが明らかになっている(Konigら, 1996)ことと、本研究で変異マウスの間接経路でenkephalinの減少が見られたことから、線条体TrkBによる攻撃行動の抑制が、間接経路におけるenkephalinの発現の調節を介したものである可能性が考えられる。

4. 攻撃行動との関与が示唆されている不安様行動について調べるため、コントロールマウスと変異マウスに対し高架式十字迷路試験を行ったところ、コントロールマウスに比べ、変異マウスはopen armへの進入頻度および滞在時間の割合が顕著に高かった。また、ガラス玉覆い隠し試験を行ったところ、コントロールマウスに比べ、変異マウスでは隠されたガラス玉の数が顕著に少なかった。これらの結果は、変異マウスでは不安様行動が減弱していることを示しており、従って、線条体TrkBは不安様行動の発現に重要であると言える。

5. 高架式十字迷路試験、ガラス玉覆い隠し試験において、変異マウスが一貫して高い行動量を示したことから、変異マウスでは自発運動活性が亢進している可能性が考えられたため、コントロールマウスと変異マウスに対しオープンフィールド試験および24時間行動量解析を行った。コントロールマウスに比べ、変異マウスはオープンフィールド試験および24時間行動量解析の暗サイクルにおいて顕著に高い自発運動活性を示した。これらのことは、線条体TrkBが新規環境および活動時間における自発運動活性を抑制的に制御していることを示している。

以上、本論文は線条体選択的なTrkBノックアウトマウスの系統を確立し、解析することにより、線条体TrkBが自発運動活性の抑制、不安様行動の発現、攻撃行動の抑制にとって重要な役割を担っていることを明らかにし、更に、攻撃行動の抑制に、線条体TrkBによる間接経路におけるenkephalin発現の調節が関与している可能性を示した。これらの結果は、先行研究でなされてきたBDNF/TrkBシグナリングの脳全体としての役割の解析ではなく、線条体に焦点を当てて解析することにより得られた新しい知見であり、運動機能障害、不安障害、攻撃行動のメカニズム解明に大きく貢献するものとして、学位の授与に値するものと考えられる。