RNA interference (RNAi) is a fundamental gene silencing pathway in eukaryotic cells. Once inside cell cytoplasm, long double stranded RNAs are cleaved by Dicer enzyme into smaller fragments known as siRNA (small interfering RNA - 21-23 nucleotides long). These fragments (siRNAs) are going to be loaded into a protein complex called RNA-induced silencing complex (RISC), in which siRNA is going to be dehybridized. The siRNA-loading "activated" RISC complex will selectively seek out for mRNAs complementary to the siRNA sequence, resulting in the cleavage of the target mRNA. Direct application of naked siRNA to control gene expression is however highly limited by unstable nature of siRNA to be digested in the bloodstream and extracellular spaces. Hence, siRNA strongly needs carrier systems to protect siRNA from enzymatic degradation and overcome biological barriers, such as the cellular membranes and endosomal entrapment.

Calcium phosphate (CaP) precipitates were first used as a transfection agent in early 1970's, as they possess inherent biocompatibility similar to natural inorganic materials such as teeth and bones. Notably, CaP precipitates can bind and encapsulate polyanions including nucleic acids to protect the payload from enzymatic degradation and to deliver into cells. One of their major limitations, however, is the uncontrollable rapid growth of calcium phosphate crystal, resulting in the formation of large agglomerates that appreciably reduce the transfection efficiency. On the other hand, hydrophilic and non-ionic poly(ethylene glycol) (PEG) is widely known to provide a nanoparticle with excellent colloidal stability as well as reduced protein adsorption and immunogenicity. In this regard, several previous studies have addressed PEG coating of CaP precipitates utilizing PEG-polyanion block copolymers. In fact, the integration of PEG-block polyanions, such as poly(aspartic acid) (PAsp), poly(methacryl acid), and siRNA, into CaP precipitates led to the formation of size-controllable hybrid nanoparticles with PEG palisade, which appreciably enhanced colloidal stability of the nanoparticles.

Herein, it was considered that the next challenge in the CaP carriers was the endosomal escape, since they are usually internalized by cells through endocytosis pathway to be delivered into acidic endosomes/lysosome, resulting in enzymatic degradation of the payload nucleic acids. In this work, a block copolymer of PEG and an endosomal escaping polyanion (PEG-PAsp(DET-Aco)) was synthesized and integrated into the CaP nanoparticles incorporating siRNA for both enhanced colloidal stability and endosomal escape of hybrid nanoparticles. PEG-PAsp(DET-Aco) possesses the flanking cis-aconitylamide, which is relatively stable at neutral and basic pHs but becomes cleavable at acidic pH, to produce cationic PAsp(DET) from anionic PAsp(DET-Aco) in late endosomal/lysosomal compartments, termed the charge-conversional polymer (CCP). Note that the cationic polyaspartamide PAsp(DET) has a 1,2-diaminoethane moiety in the side chain, that exerts strong membrane destabilization selectively at acidic pH, but not at neutral pH based on the change in the protonated form between neutral and acidic pHs, thereby allowing efficient endosomal escape with low cytotoxicity. The hybrid nanoparticles containing CCP and siRNA were physicochemically and biologically characterized by the comparison with non-charge-conversional control polyanions (non-CCP).

Successful synthesis of PEG-CCP and its controls was confirmed by GPC and 1H NMR measurements. Size controlled nanoparticles were then obtained after two step mixing of a solution of siRNA coding vascular endothelial growth factor (VEGF) in HEPES buffer (pH 7.5) with another solution of HEPES containing PO4-3 (pH 7.5), and then with the other containing the polymer (pH 7.5) and CaCl2 in Tris buffer (pH 7.5~10). The cumulant size and polydispersity index (PdI) of prepared nanoparticles were determined by dynamic light scattering, and consequently the particles size was in the range between 50-100 nm, while the PdIs were from 0.06-0.14, indicating the narrow size distribution. Transmission electron and atomic force microscopic images further reveled the spherical morphology of the nanoparticles. Effective encapsulation of siRNA in the nanoparticles (around 80%) was confirmed in preparation with PEG-PAsp(DET-Aco) at the initial concentration between 600 and 2000 μg/mL, while a slight decrease was observed at the concentration of 3000 μg/mL (around 70%).

The hybrid nanoparticles were confirmed to have negligible cytotoxicity to a pancreatic cancer cell (PanC-1) even at the highest concentration tested (50 μg/mL PEG-polyanion, 1.5 μM siRNA). Confocal laser scanning microscopy showed that all the tested nanoparticles were efficiently uptaken by PanC-1 cells, but only nanoparticles containing CCP presented excellent endosomal escape after 3 hours of application. Precisely, a large fraction of Cy5-labeled siRNAs was not colocalized with late endosome/lysosome stained by LysoTracker, indicating early escape from endosomes. On the other hand, at 24 hours colocalization of siRNAs with LysoTracker was decreased in all the tested nanoparticles, suggesting that calcium phosphate core disassembly in a low ionic condition may inherently facilitate endosomal escape of siRNA, but not as early as the case of CCP. The real-time PCR analysis revealed that VEGF siRNA delivered to PanC-1 cells by CCP-containing hybrid nanoparticles promoted the highest gene knockdown in vitro up to 80% among the tested samples including the control with the non-CCP, consistent with the finding in confocal microscopic observation showing the efficient endosomal escape of the hybrid nanoparticles with PEG-PAsp(DET-Aco).

After the optimization in nanoparticle preparation for purification, hybrid nanoparticles were applied for in vivo experiments. Treatment of mice bearing BxPC3 (tumorigenic pancreatic cancer cell line) subcutaneous tumors with nanoparticles containing CCP and VEGF siRNA presented a slower tumor growth compared to that treated by scramble siRNA and HEPES buffer as a negative control. After 3 injections of 25μg VEGF siRNA per mouse (n=6), the relative tumor volume was significantly smaller at days 9, 11 and 13, compared to the negative control. Although from the day 15 all the tumors reached the similar growth rate, VEGF siRNA-treated tumors were smaller than those treated by the control at the day 26. Indeed, VEGF siRNA delivered by CCP-containing nanoparticles was confirmed to promote VEGF mRNA knockdown in the tumor tissue by real-time PCR, indicating that the slow growth rate was correlated to the inhibition of the pro-angiogenic factor. Using a different payload (luciferase siRNA), hybrid nanoparticles promoted the luminescence decrease in an extra in vivo model, after intravenous injection. The siRNA sequence was previously validated in vitro in luciferase expressing cells. The systemically injected nanoparticle is believed to accumulate in the tumor tissue by Enhanced Permeation and Retention (EPR) effect.

Finally, freeze-thawing cycles and freeze-drying of the nanoparticle solution were investigated for possible improvements in stability under in vivo conditions and long-term storage. The successful procedures allow the translation of the system into pharmaceutics.

In conclusion, this work is presenting a novel carrier system to explore RNAi therapeutics with the improved colloidal stability and endosomal escape. The in vitro results suggest that the siRNA is safely and efficiently delivered to cytoplasm to promote VEGF gene knockdown. Further, intravenously injected hybrid nanoparticles demonstrated the in vivo utility in cancer treatment as a promising candidate to realize therapeutic applications of siRNA.

siRNAは、その強力な遺伝子発現抑制効果(RNAi)に基づき、がんなどに代表される従来の方法では治療困難な疾患に対する治療に、その応用が大いに期待されている。しかしながら、現在までに10件弱の臨床治験が行われたものの、治療法としていまだ承認を得ていない。その最大の要因は、安全かつ効率良くsiRNAを標的とする細胞の細胞質に導入する技術が確立されていないことである。外科手術では治療困難ながんを治療するには、全身投与を介した標的腫瘍組織へのsiRNAデリバリーが強く求められる。ここで裸のsiRNAを投与した場合、1) 血液中の酵素により速やかに分解され、腫瘍組織への到達効率は低くなり、2)また一部が標的細胞に取り込まれたとしても、分解オルガネラであるエンドソーム/リソソームへ運ばれた後に代謝されてしまう。結果として、標的細胞質まで到達できるsiRNA量は著しく低下することになる。よって、全身投与を介したsiRNAがん治療を実現するには、siRNAを血中で保護し、腫瘍組織に効率良く集積し、さらにはエンドソームから細胞質へと移行するキャリアシステムの開発が必要と考えられる。本論文では上記課題を解決するために、核酸担持能を有するリン酸カルシウム(CaP)粒子に着目すると共に、「生体内(血流中)での安定性」および「エンドソーム脱出能」を搭載した新たなsiRNAキャリア材料の開発を行っている。具体的には、生体適合性の高いポリエチレングリコール(PEG)と酸性(pH ~5)環境に応答してポリアニオンからポリカチオンへと構造を変化させるチャージコンバージョンポリマー(CCP)のブロック共重合体(PEG-CCP)を合成し、リン酸カルシウム、siRNAの間で、有機-無機ハイブリッドナノ粒子を新規に構築している。これにより、CaP封入に基づくsiRNA保護、PEG化CaPナノ粒子(< 100nm)によるがんへの集積、CCPに誘起されるエンドソーム膜傷害に基づくエンドソーム脱出が付与され得る。以下に、各章ごとに対する審査結果の概要を述べる。

第一章の序論では、siRNAの構造的特徴とその医療応用状況および改善すべき点を記述すると共に、siRNAによるがん治療に向けた血管新生阻害療法、キャリア設計指針についてまとめている。その中で、CaP粒子は生体由来成分であり、かつsiRNAを含むポリアニオン分子の封入が可能であることから、siRNAキャリアとして高い適性を有することが述べられている。一方で、従来のCaP粒子は凝集しやすく、またエンドソーム脱出機能に乏しいことを改善点として挙げ、それを解決するための方法としてPEG-CCPを提案し、本研究の意義および妥当性を述べている。

第二章では、PEG-CCPおよびコントロールとして酸性環境応答性を有していないPEG-nonCCPの合成および同定結果がまとめられている。本研究では、ポリアスパラギン酸(PAsp)側鎖にジエチレントリアミン(DET)が導入されたPAsp(DET)の1級アミノ基に無水cis-アコニチン酸(Aco)を反応させたPAsp(DET-Aco)をCCPセグメントとして合成している。得られたPEG-PAsp(DET-Aco)に対しては、GPC測定により単分散な分子量分布を、1H-NMR測定により定量的な側鎖構造変化を確認している。PEG-PAsp(DET-Aco)は、中性pHではポリアニオンとして低毒性かつ安定であるが、エンドソームの様な酸性環境下ではcis-アコニチルアミドが分解し、ポリカチオンPEG-PAsp(DET)となりエンドソーム膜傷害を惹起することが述べられている。一方、PEG-nonCCPとしては、PAsp(DET)の側鎖に無水カルバリリル酸(Car)が導入されたPEG-PAsp(DET-Car)を合成している。Carは、Acoの2重結合が単結合になった構造を有しており、酸性pH応答性が著しく低下することを記述している。

第三章では、調製されたPEG-PAsp(DET-Aco)(もしくはPEG-PAsp(DET-Car))/CaP/siRNAナノ粒子の物理化学的解析結果および培養細胞に対するsiRNAデリバリー能がまとめられている。まず、ナノ粒子が調製されたことを、動的光散乱に基づく粒子径および粒子径分布測定と透過型電子顕微鏡観察により確認している。結果として、PEG-PAsp(DET-Aco)濃度800μg/mL以上での粒子調製を介して、単分散(polydispersity < 0.2)かつ粒子径100nm以下の粒子が調製されることを明らかにしている。同様の条件下におけるsiRNA封入率も定量しており、溶液中の約80%のsiRNAがナノ粒子に担持されたことを明らかにしている。そして、培養細胞実験より、得られたナノ粒子は非常に低毒性であること、siRNAの配列特異的かつ強力なRNAi活性を有することを明らかにしている。特筆すべきは、共焦点レーザー顕微鏡を用いたsiRNAキャリアの細胞内動態観察を通じて、PEG-PAsp(DET-Aco)/CaP/siRNAの優れたRNAi活性は、設計指針通りのエンドソーム脱出によってもたらされることを実験的に示したことである。蛍光標識siRNAとエンドソーム/リソソーム染色を介して両者の共局在率を見積もったところ、PEG-PAsp(DET-Aco)によるキャリアは、PEG-PAsp(DET-Car)によるキャリアと比べ、明らかに共局在率が低いことを確認している。

第四章では、ナノ粒子キャリアのin vivo機能(動物実験)についてまとめている。マウスを用いた抗腫瘍効果の実験では、血管新生阻害を誘導する血管内皮増殖因子(VEGF)に対するsiRNAをナノ粒子に搭載させることで、難治性として知られる皮下移植膵臓がんモデルに対して、優れた抗腫瘍効果を得ることに成功している。摘出した腫瘍組織におけるVEGF mRNA量を定量することで、得られた抗腫瘍効果は、配列特異的かつ有意なRNAi活性に基づくものであることが示されている。特筆すべき点は、25μg siRNA/mouseの1回投与により有意な抗腫瘍効果が得られていることであり、これは現在までに報告されている他のsiRNAキャリアと比べても、最も優れた効果の一つと考えられる。さらに、ナノ粒子化によるsiRNAの血中安定化については、in vivo共焦点レーザー顕微鏡による血流観察により証明している。

第五章では、ナノ粒子の保存安定化に向けての検討についてまとめている。CaP粒子は、特に凝集しやすいことからその保存安定性が懸念事項であった。本章では、PEG-CCP(およびPEG-nonCCP)被覆を通じて、CaP粒子のコロイド安定性が飛躍的に高まり、長期に渡る粒子径の維持に寄与することを明らかにしている。また、凍結-融解(freeze-thaw)の過程を経ることにより、希釈安定性が有意に高まることを見出した点は非常に興味深い発見である。

最後に総括として、一連の研究結果のまとめとsiRNAデリバリーにおける展望についてまとめている。

以上、本論文では、PEG-CCP/CaP/siRNAから成るハイブリッドナノ粒子に基づいて、がんへの効果的なsiRNAデリバリーを可能とする優れたキャリアが構築されることを実験的に明らかにしている。細胞内動態を制御する高分子材料PEG-CCPを創製するだけでなく、物理化学的評価から細胞・動物実験に至る一連の実験を行い、最終的には難治性で知られる膵臓がんモデルに対する有意な治療効果を得ることに成功している。よって本論文に記されたsiRNAキャリア設計指針の意義は、幅広い評価を通じて支持されており、世界的に実用化が期待されているsiRNAキャリア開発に、バイオエンジニアリング、特にバイオマテリアル創発の見地から多大な寄与を与えるものと判断される。

よって本論文は博士(工学)の学位請求論文として合格と認められる。