Development of drugs for the treatment of diseases of the central nervous system (CNS) remains challenging. For drugs that act in the central nervous system (CNS), it is assumed that an unbound drug in the interstitial fluid in the brain is available to interact with the target site in the CNS. The unbound concentration is therefore a surrogate for the bound concentration at the target site. It is well known that drug concentrations in the blood are not good predictors of the pharmacological actions of CNS-directed drugs, because the blood-brain barrier (BBB), formed by a tight monolayer of brain capillary endothelial cells, limits the penetration of drugs into the brain. The purpose of this study was to investigate drug transport across the human blood brain barrier based on in vitro data and clinical positron emission tomography (PET) data.

PET has high sensitivity and spatial-temporal resolution. Using PET probes for the CNS targets, the interaction of drugs with their target proteins has been evaluated in vivo. Here, in this study, receptor occupancy (RO) was used as an index of the unbound concentration in the CNS to investigate the drug transport across the human BBB. A pharmacokinetics-receptor occupancy (PK-RO) model, combined with physiological and biochemical parameters, was constructed to simulate RO. Taking into account probe specificity, the available time course of RO in humans and a lack of confounding metabolites, the dopamine D2 receptor antagonists olanzapine, haloperidol, paliperidone (9-OH metabolite of risperidone), and sulpiride, were selected as test drugs in this study.

In Chapter 1, the disposition of D2 receptor antagonists was investigated in the human brain using a physiologically based pharmacokinetic model. The membrane fractions were prepared from Human Embryonic Kidney (HEK) 293 cells transfected with human D2L cDNA, which is the predominant form of two isoforms of the dopamine D2 receptor. The specific binding of [3H]raclopride is saturable (Kd = 1.2 nM and Bmax = 21.9 ± 0.7 pmol/mg protein) and reversible. Non-specific binding accounts for less than 2% of the total binding. Replacement of [3H]raclopride by D2 receptor antagonists was rapid enough to assume rapid equilibrium. The Ki values of olanzapine, haloperidol, paliperidone and sulpiride were 8.30, 1.17, 2.70 and 15.6 nM, respectively. RO of the D2 receptor by its antagonists in the human brain was predicted with the PK-RO model based on physicochemical properties of model compounds, in vitro parameters and in vivo human plasma concentration time profiles. Assuming passive diffusion across the BBB (PSinf = PSeff), the RO by olanzapine and haloperidol were underestimated, whereas those by paliperidone and sulpiride were slightly and markedly overestimated respectively. The sensitivity analysis showed that PSinf/PSeff ratio had a significant effect on the prediction of occupancy. To explain the clinical data, the influx of olanzapine and haloperidol must have been 6.9-fold and 8.2-fold greater than their efflux, whereas that of paliperidone and sulpiride must have been 1.5- and 55-fold smaller than their efflux. These results suggest that the transporters are involved in the influx or efflux process of the D2 receptor antagonists across the human BBB. This prediction was supported by a clinical study (Arakawa et al., J Clin Psychiatry 71:1131-7, 2010.) that reported that the RO by olanzapine, haloperidol, and risperidone were higher in the human cerebral cortex (within the BBB) than in the pituitary (outside the BBB), whereas the RO by sulpiride was lower in the cerebral cortex.

In Chapter 2, the BBB transport of model compounds was characterized in hCMEC/D3 cells, an immortalized cell line derived from human brain capillary endothelial cells. Olanzapine, haloperidol, risperidone, paliperidone and sulpiride were all transported into hCMEC/D3 cells in a time- and temperature-dependent manner. The uptake of olanzapine, haloperidol, risperidone, and paliperidone were saturable with Km values of 6.12, 17.6, 17.1 and 46.4 μM, respectively. Digitonin treatment caused a marked reduction in the intracellular accumulation of olanzapine. The uptake of olanzapine was inhibited by cationic drugs, such as pyrilamine, quinidine, verapamil, diphenhydramine and amantadine, but not by TEA and MPP+ (substrate/inhibitor of OCT, PMAT or MATE), ergothioneine (a specific substrate of OCTN1), L-carnitine (a substrate of OCTN2), choline (a substrate of the choline transport system) and cimetidine (substrate/inhibitor of OCT or MATE). Pyrilamine is a competitive inhibitor, and a trans-stimulation by pyrilamine was observed for the initial uptake of olanzapine, haloperidol, risperidone, and paliperidone: the uptake was significantly enhanced by preloading cells with pyrilamine. The transport was significantly reduced by sodium azide (a metabolic inhibitor) or FCCP (a protonophore). The olanzapine uptake was increased at extracellular pH (8.5) or intracellular acidification, but was reduced by intracellular alkalization. Thus, the putative pyrilamine transporter likely mediates the uptake of olanzapine, haloperidol, risperidone and paliperidone in hCMEC/D3 cells. The brain uptake of olanzapine, haloperidol, risperidone, paliperidone, and sulpiride was further investigated using in situ mouse brain perfusion. The brain uptake of olanzapine and haloperidol was similar to that of diazepam, a flow-rate marker, whereas the brain distribution of sulpiride was similar to the vascular volume. Diphenhydramine significantly inhibited the brain uptake of olanzapine, haloperidol, and risperidone, but not paliperidone. These results suggest that the influx transporter contributes substantially to the efficient transport of olanzapine, haloperidol, and risperidone into the brain across the BBB, and thus the underestimation of RO by olanzapine and haloperidol can be explained.

To understand the efflux mechanisms involved, a transcellular transport study was performed. The BBB expresses P-gp and BCRP, which actively extrude drugs into the blood. Unlike olanzapine and haloperidol, the directional transport of risperidone and paliperidone was induced by the exogenous expression of P-gp, but not by BCRP, in MDCK II cells, indicating that these two drugs are good substrates for P-gp, but not BCRP. Furthermore, the brain distribution of olanzapine, risperidone and paliperidone in P-gp knockout mice were all significantly increased compared with those in wild type mice. Overestimation of the RO by paliperidone is attributed to its active efflux by P-gp at the BBB, whereas neither P-gp nor Bcrp accounts for the efflux of sulpiride.

The present study characterized the transport of the D2 receptor antagonists in the human BBB. A putative pyrilamine transporter contributes substantially to the efficient transport of olanzapine and haloperidol into the brain across the BBB, and to their therapeutic outcomes. On the other hand, both uptake and efflux transporters (putative pyrilamine transporter and P-gp) determine the therapeutic outcomes of risperidone and paliperidone, and unknown efflux transporter is involved in the extensive efflux of sulpiride at the BBB. Thus, PK-RO analysis of the CNS acting drugs is useful to investigate their transport mechanisms in the human BBB. This study suggests that the drug transport systems at the BBB are far more diverse than it was assumed to be. The putative pyrilamine transporter will be a target protein to improve CNS penetration of drugs. Identification of the responsible transporter will contribute to the drug development of the CNS acting drugs.

中枢神経系(CNS)医薬品の開発成功確率は他の疾患領域と比較して低く、成功確率を改善するための手法が求められている。CNSでは、細胞間液中あるいは細胞内の非結合型薬物が、標的分子と相互作用することから、医薬品のCNS効果は非結合型薬物濃度に依存する。CNSと血液間の物質交換が迅速に行われる場合、血液中の非結合型薬物濃度とCNSの実効濃度は等しく、血液中の非結合型薬物濃度がCNS効果の指標となる。しかし、CNSは血液脳関門(BBB)と呼ばれる関門により血液とは隔てられているため、CNSの非結合型薬物濃度と血液中の非結合型薬物濃度との間には乖離が存在する場合がある。BBBを形成する脳毛細血管内皮細胞は、細胞間に発達したtight junctionを形成しているため、薬物をはじめとして低分子化合物の細胞間隙を介した透過は制限されている。血液中からCNSへの移行経路は経細胞輸送が主経路となるため、膜透過性の低い薬物(水溶性分子、高分子量)に対して、脳毛細血管は拡散バリアとして働く。さらに、P-糖タンパク(P-gp)をはじめとするトランスポーターが医薬品を能動的に血液中へとくみ出しており、こうしたトランスポーターの基質となる薬物については、CNSの非結合型薬物濃度は血液中の非結合型薬物濃度に比較して低くなり、CNS効果は血液中非結合型薬物濃度から期待されるほど高くはない。BBBにおける薬物輸送機構を明らかにすることは、CNS医薬品を開発する上で重要な課題である。

Positron emission tomography (PET)を用いることで、非侵襲的かつ高解像度に脳内の標識薬物の分布を測定することが可能になる。受容体に対する選択的なPET分子プローブを利用することで、これまでにCNS作用薬の標的分子との相互作用がin vivoで測定されてきた。本研究は、受容体占有率(RO)を脳内の非結合型薬物濃度の指標として利用することで、ヒトin vivoにおけるBBB透過性に関する知見を得ることを目的として行われた。PET分子プローブの特異性、ヒト脳内受容体占有率の時間推移データが入手できること、受容体結合能を有する代謝物が生成しないことを条件として、300を超える文献検索を行った結果、統合失調症治療薬であるドーパミンD2受容体拮抗薬olanzapine、haloperidol、paliperidone(risperidoneの9-OHの代謝物)、およびsulpirideをモデル薬物として選択し、以下の研究が行われた。

Chapter 1では、生理学的モデルを用いたD2受容体拮抗薬の脳内動態解析が行われた。ヒトD2受容体(D2L)過剰発現細胞から調製した膜画分を用いたin vitro結合試験により、D2受容体拮抗薬による阻害能をin vitroで測定した。[3H]racloprideの結合は飽和性 (Kd =1.2 nM and Bmax = 21.9 ± 0.7 pmol/mg protein)を示し、非特異的な結合量は総結合の2%未満であることから、実験系における選択性を確認した。D2受容体拮抗薬による[3H]racloprideとの交換は十分迅速であり、D2受容体との結合・乖離は迅速平衡を仮定できることが確認された。また、本実験系を用いてolanzapine、haloperidol、paliperidoneおよびsulpiride のD2L受容体対するKi値(それぞれ8.30、1.17、2.70 および15.6 nM)が測定された。

血液と脳毛細血管管腔内スペース、CNSの3つのコンパートメントからなる速度論(PK)モデルを構築し、脳内の非結合型薬物濃度とin vitroで測定されたKi値から、受容体占有率を計算した。ヒト血漿中薬物濃度時間推移は文献値を用い、モデル化合物の物理化学的性質からBBB透過性を推定した他、in vitroでラット脳ホモジネートを用いて脳内の非結合型薬物分率を測定した。BBB透過に受動拡散(PSinf = PSeff)のみを仮定した場合、olanzapineとhaloperidolによる受容体占有率の予測値は実測値を再現できず、過小評価した。反対に、paliperidoneとsulpirideによる占有率は過大評価された。脳内非結合型薬物分率、BBB透過性、血流速度などモデルで使用するパラメーターに関して感度分析を行った結果、脳内の非結合後型薬物分率や血流による影響は見られず、PSinf/PSeff比がもっとも影響を与える要因であることを確認した。臨床データを説明するためには、olanzapineとhaloperidolの脳内への取り込み過程は排出過程の6.9倍と8.2倍高い必要があり、反対にpaliperidoneとsulpirideはそれぞれ1.5倍と55倍低い必要がある。すなわちolanzapineとhaloperidolはBBBにおいてトランスポーターにより能動的にCNSへと取りこまれ、反対にpaliperidoneとsulpirideは能動的な排出を受けることを示唆している。Arakawaらは、PETにより大脳皮質と下垂体でのD2受容体占有率を比較した結果、ヒト大脳皮質では、olanzapineおよびhaloperidolの占有率は脳下垂体より2-3倍高く、sulpirideの占有率は反対に下垂体の方がはるかに高いことを報告している(J Clin Psychiatry 71:1131-7, 2010.)。下垂体とは異なり、大脳皮質ではBBBが存在するため、本来は受容体占有率は下垂体での値を下回るはずである。大脳皮質の方が受容体占有率の方が高いとする本臨床試験の結果は、本研究で行われた予測計算を支持するものである。

Chapter 2では、Chapter1の結果を支持するため、ヒト脳毛細血管内皮細胞由来の不死化細胞(hCMEC/D3)を用いてモデル化合物のin vitro輸送試験が行われた。hCMEC/D3細胞内へのolanzapine、haloperidol、risperidone、paliperidoneおよびsulpiride取り込みは経時的に増加し、4℃では取り込みが顕著に低下し、明確な温度依存性を示した。さらに、Olanzapine、haloperidol、risperidoneおよびpaliperidoneの取り込みは飽和性を示し、digitonin処理により大きく取り込みが低下することから、細胞膜上での結合の寄与は無視できることを確認した。pyrilamineなどカチオン性薬物によりolanzapineの細胞内取り込みは阻害されるものの、既知有機カチオントランスポーター(OCT、PMAT、MATE)の阻害剤による効果は小さく、新規の有機カチオントランスポーターの関与が示唆された。Pyrilamineはolanzapineの細胞内取り込みに対して競合的な阻害を示し、pyrilamineを予め細胞内にプレロードし、外向きのpyrilamine濃度勾配存在下では、olanzapine、haloperidol、risperidoneおよびpaliperidoneの細胞内取り込みは促進され、明確なtrans-stimulation効果が観察された。以上の結果は、putative pyrilamine transporterがこれら薬物の輸送にも関与していることを示唆するものである。sodium azide(代謝阻害剤)あるいはcarbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenyl(プロトノフォア)処理により取り込みが低下すること、ならびにpH依存性も観察されたことから、H+との対抗輸送が輸送駆動力と考えられる。ICRマウスを用いたin situ 脳灌流法により、olanzapine、haloperidolおよびrisperidoneのBBB透過性を評価したところ、いずれの薬物のBBB透過性はdiphenhydramine存在下では低下した。しかし、paliperidoneのBBB透過性に対する阻害効果は認められなかった。上記の結果は、hCMEC/D3細胞ならびにマウスBBBに、olanzapine等を基質とするトランスポーターの発現を支持するものである。

Olanzapineやhaloperidolとは異なり、risperidoneとpaliperidone は、BBBに発現する異物排泄トランスポーターP-gpの基質となることを確認した。P-gp過剰発現細胞を用いたin vitro細胞透過試験では、コントロール細胞に比較して有意な輸送能力が観察された他、野生型マウスと比較して、P-gpノックアウトマウスではolanzapine、risperidoneとpaliperidoneの脳内分布が有意に増加した。BBBに発現する排出トランスポーターBCRPについては、いずれの化合物も基質とならないことが確認された。Paliperidoneによる受容体占有率の過大評価は、BBBにおけるP-gpによる能動排出によるものと考えられる。Sulpirideに関しては、予測値では排出輸送が取り込み輸送を大きく上回る結果となったが、P-gp、Bcrpいずれのトランスポーターでも説明することはできず、さらなる検討を必要とする。

以上、本研究では、脳D2受容体占有率を脳内非結合薬物濃度の指標として利用することで、ヒトin vivoにおける薬物のBBB透過性に関する知見を得ることができた。従来、脂溶性の高いカチオン性薬物は、単純拡散によりBBBを透過すると考えられてきたが、D2受容体拮抗薬など一部薬物については取り込み過程にはトランスポーターによる能動輸送が関与しているとする結果は、新しい知見である。当該トランスポーターはCNS作用薬の脳送達素子として、CNS移行性の優れた薬物の開発に貢献できることを提起している。これらの成果は薬物動態研究の進展に貢献するものであり、本研究を博士(薬学)の学位を授与するに値するものと認めた。