Cdc7/Hsk1 is a conserved kinase required for initiation of DNA replication, and Mrc1 is known to be required for maintenance of replication fork integrity under replication stress. We show here that, in fission yeast, the timing and efficiency of initiation at early-firing origins is facilitated in mrc1Δ, but not in mrc1-3A mutant or cds1Δ in which DNA replication checkpoint is deficient. Timing of Cdc45 loading is also advanced specifically in mrc1Δ. Strikingly, mrc1Δ can bypass hsk1Δ lethality, suggesting that an essential role of Hsk1 may be to relieve the inhibition caused by Mrc1. Mrc1 binds selectively to early-firing origins in a manner independent of Hsk1 after Mcm4 loading but prior to Cdc45 loading. We speculate that this binding transiently inhibits Cdc45 loading and initiation and phosphorylation by Hsk1 triggers the initiation. Our results indicate novel checkpoint-independent functions of Mrc1 for timely and regulated initiation of fission yeast DNA replication.

Furthermore, with a hope that bypass mutants of hsk1Δ may represent novel regulators of origin regulation, we isolate four novel insertion mutants which can bypass hsk1Δ lethality. Among them, a null mutant of rif1, which is a telomere maintenance factor binding to telomere in a Taz1 dependent manner, exhibits more efficient bypass than mrc1Δ did. Rif1 binds to specific late origin in M phase and moves away in S phase, and late origin firing is observed over a wide range on chromosome, although Rif1 does not required for DNA replication checkpoint. As Hsk1 and its regulation factor of Him1/Dfp1 interact with Rif1, Rif1 might regulate replication program in S phase through Hsk1 function. Our results suggest that timely firing of replication origins in fission yeast may be regulated by Hsk1 in conjunction with multiple other factors including Mrc1 and Rif1.

本論文は、個体発生や、細胞の分化などの制御メカニズムとの関係が報告されてきているDNA複製開始の場所やタイミングを決める「複製プログラム」を制御する因子の単離と、それらの機能解析に関するものである。Hsk1/Cdc7は複製開始起点からのDNA複製が開始される際に重要なリン酸化反応を行なう保存されたキナーゼである。申請者は、分裂酵母をもちいて、hsk1-89温度感受性変異体やhsk1欠損変異体の致死を抑圧する変異体を単離するという遺伝学的手法を用いて「複製プログラム」を制御する新規因子mrc1,rif1を同定した。さらにこれらによる制御メカニズムについて解析を行った。

申請者はMrc1による制御メカニズムを解析するため、mrc1欠損変異体やMrc1のDNA複製チェックポイント変異であるmrc1-3A変異体におけるDNA複製開始や複製フォークの進行を、2次元アガロース電気泳動法を用いて検討しsた。さらにMrc1や複製開始因子であるCdc45のクロマチン免疫沈降法(ChIP)や、ゲノムワイドで結合部位を同定するChIP-chip法によって、Mrc1は、MCM複合体が結合した後、Cdc45が結合する前にHsk1やCdc45非依存的に、初期複製開始起点に選択的に結合し、チェックポイント非依存的にCdc45の結合を阻害することで初期複製開始起点からのDNA複製開始のタイミングを制御していることを明らかにした。さらに、この阻害的制御をHsk1が解除する可能性が考えられるが、実際に本論文においてMrc1はDNA複製が開始される時期に一過性にHsk1依存的にリン酸化されていることを示している。

一方、hsk1欠損はmrc1欠損によって致死性が抑圧されるが、mrc1-3A変異体や、cds1欠損変異体によってもmrc1欠損は部分的ではあるが抑圧される。これは実際に、DNA複製阻害剤であるHU(ヒドロキシ尿素)存在下でのDNA複製を、BrdUを取り込ませた細胞を用いてChIP-chipで解析したところ、後期複製開始起点からのDNA複製がmrc1欠損及び、cds1欠損変異体において弱く観察されると共に、これらの変異体においてCdc45とMcm2の相互作用が増加していることが示された。これらから、Mrc1はチェックポイント依存的な経路によっても、後期複製開始起点からのDNA複製開始をCdc45のMCM複合体への結合を阻害することで制御していると結論した。

本論文では、新規な複製プログラム制御因子を単離するため、hsk1欠損細胞の致死を抑圧する因子のスクリーニングを行い、新たに16株単離し、1つがmrc1であり、4つがrif1という進化的に保存された新規因子であることを発見した。Rif1はTaz1やRap1と共にテロメア長の維持に必要な因子であることが報告されているが、taz1欠損やrap1欠損はhsk1-89変異を抑圧しないこと、rif1欠損変異体がDNA複製阻害剤やDNA損傷への感受性がないことから、テロメア維持機能やチェックポイント非依存的にhsk1欠損の致死を抑圧していることが明らかとなった。実際にrif1欠損変異体においてテロメア領域を含め、多くの後期複製開始起点からのDNA複製が脱制御されていることがBrdUのChIP-chipから示された。またRif1のChIP解析から、Rif1は初期複製開始領域には結合しないが、後期複製開始起点の一部(ori4251)にM-G1期に結合することから、Rif1は複製開始前に複製開始起点の一部に結合し複製プログラムを制御している可能性が示唆された。同時に、rif1欠損変異体では第3染色体のように初期複製開始活性の高い領域では一部の起点からのDNA複製が抑制される。これらの結果からRif1はMrc1とは異なる機構で、DNA複製プログラムを正および負に制御する因子であることが示された。本論文は、hsk1変異体を用いることで「複製プログラム」を制御する因子を単離するという申請者独自の手法を用いており、遺伝的解析を元に、複製プログラムを制御する二個の新規因子を同定し、さらに2次元アガロース電気泳動やChIP-chip法などを用いてそれらによる制御機構の詳細に迫った優れた論文であり、博士論文として学位に値する内容であると判断する。。今後、より詳細なタンパク質間相互作用なども含め、多くの解析が進むとともに、転写を含めた細胞内の機能との関連性についても解析が進むことが期待される。また、学位審査会における、早野元詞君の質疑応答の際の受け答えも、適切であり、学位に値する知識、学識を有していると判断された。

なお、本論文は、当研究室の松本清治、加納豊博士との共同研究であるが、論文提出者が主体となって分析及び検証を行ったもので、論文提出者の寄与が十分であると判断する。以上の理由により、早野元詞君に博士(生命科学)の学位を授与できると認める。