Hydrogen sulfide (H2S) has recently been recognized as a signaling molecule produced in many tissues. H2S facilitates the induction of hippocampal long-term potentiation (LTP) by enhancing the activity of N-methyl D-aspartate (NMDA) receptors in neurons and induces Ca(2+) influx in astrocytes. Vascular smooth muscle is relaxed by H2S, which can be released from endothelium as well as smooth muscle. H2S has pro- and anti-inflammatory effects, nociceptive effects, proangiogenic effect and the regulatory function of insulin release. In addition to a function as a signaling molecule, H2S can protect cells against oxidative stress. H2S protects neurons from oxidative stress by reinstating the levels of glutathione (GSH), a major intracellular antioxidant, by enhancing the activity of γ-glutamylcysteine synthetase and the transport of cysteine and cystine. Cardiac muscle is also protected by H2S from ischemia-reperfusion injury by preserving mitochondrial function.

H2S is produced by three enzymes, cystathionine β-synthase (CBS), cystathionine γ-lyase (CSE) and 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase (3MST). In the central nervous system, CBS is mainly localized to astrocytes, and 3MST to neurons. 3MST produces H2S from 3-mercaptopyruvate (3MP), which is generated by cysteine aminotransferase (CAT) from cysteine and a-ketoglutarate (a-KG). However, the cellular distribution and regulation of these enzymes are not well understood.

3MST requires a reducing substance such as dithiothreitol (DTT) to release H2S. The physiological reducing substance has not been identified. The present study shows that thioredoxin (Trx) and dihydrolipoic acid (DHLA) can release H2S from persulfide provided by 3MP at the active site of 3MST. Monothiols such as cysteine, GSH and coenzymeA (CoA) as well as the other reducing substances did not show any effect on H2S-production. 3MST depends on the dithiols, Trx and DHLA, for the production of H2S from 3MP. H2S can be produced from thiosulfate in the presence of high concentrations of DHLA. The H2S production from 3MP and thiosulfate by 3MST is suppressed in the presence of sulfite. These results provide a molecular mechanism for the production of H2S catalyzed by 3MST.

The present study also shows that 3MST and CAT are localized to retinal neurons and that the production of H2S is regulated by Ca(2+). H2S can suppress high concentration K+-induced Ca(2+) influx in the outer nuclear layer of the retina. Feedback from horizontal cells to photoreceptor cells is mediated by the suppression of L-type Ca(2+) channels on photoreceptor cells by protons released from vacuolar type H+-ATPase (V-ATPase) on horizontal cells. H2S activates V-ATPase on horizontal cells to release protons that suppress L-type Ca(2+) channels on photoreceptor cells. Under physiological conditions, H2S may maintain intracellular Ca(2+) in low levels. The regulation of Ca(2+) by H2S may be failed by the excessive levels of light, and the photoreceptor cell degeneration occurs. The excessive levels of light exposure deteriorated photoreceptor cells and increased the number of terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL)- and 8-hydroxy-2´-deoxyguanosine (8-OHdG)-positive cells. Degeneration was greatly suppressed in the retina of mice administered with NaHS, a donor of H2S. Even under such conditions the administration of sodium hydrosulfide (NaHS), a donor of H2S, suppresses light-induced photoreceptor degeneration. These observations suggest that H2S protects photoreceptor cells from the insult caused by excessive levels of light.

本研究は、ガス状生理活性物質である硫化水素(H2S)について、生合成経路の制御機構および生理機能を明らかにすることを目的としており、マウス脳におけるH2S生産酵素の活性化因子の探索および網膜におけるH2Sの生理機能の解析を試みたもので、下記の結果を得ている。

1.Cysteine aminotransferase(CAT)はシステインとα-ケトグルタル酸(α-KG)から3-メルカプトピルビン酸(3MP)を生合成し、それを基質として3MSTがH2Sを生産する。3MSTは、H2S生産に還元性物質が必要とするが、生体内で実際に機能している補因子は不明であった。そこで、3MSTが豊富に存在するマウス脳ミトコンドリア画分に基質3MPを添加しガスクロマトグラフィーでH2S生産を測定する方法を用い、3MSTの還元性補因子を探索した。その結果、チオレドキシンとジヒドロリポ酸(DHLA)を還元性補因子として同定した。分子内に2つの還元活性を有するチオール基が存在する構造が重要であり、3MSTによるH2S生産の分子機序を提唱した。

2.3MSTは、チオ硫酸イオウ転移酵素(ロダネーゼ)と相同性が高いことから、チオ硫酸(S2O3(2-))代謝に関与する可能性が考えられる。そこで、3MSTを過剰発現させたHEK293F細胞を用いてチオ硫酸を基質とした場合の3MSTによるH2S生産を確認した。その結果、3MSTはチオ硫酸からH2Sを生産し、亜硫酸イオン(SO3(2-))存在下で抑制されることを明らかにした。ロダネーゼに加え、3MSTもチオ硫酸代謝に関与するという知見を加えた。

3.細胞内で生産されたH2Sは、結合型イオウとして貯蔵され、還元条件下で放出されることが知られている。そこで、結合型イオウ放出に対する生体内還元性物質の寄与を検証した。その結果、DHLAが結合型イオウを切断・放出しうることを明らかにした。生体内に貯蔵されるH2Sを放出する因子の一つを新たに同定した。

4.網膜における3MSTとCATの局在を明らかにすることを目的として、免疫組織化学的手法による解析を行った。その結果、3MSTとCATがマウス網膜の神経細胞に広く共局在すること、さらに水平細胞特異的マーカーのカルビンジンと3MSTが共局在することを確かめた。他のH2S生産酵素の局在は確認できなかったことから、網膜における主要なH2S生産酵素は3MSTであると考えられる。

5.組織学的解析の結果を受けて、H2S生産経路を生化学的に検討した。網膜ではシステインとα-KGの組み合わせからH2Sが生産された。3MST/CAT経路が主経路であることが確認できた。さらに、H2S生産の制御因子の検討を行った。その結果、Ca(2+) による制御を受け、100 nM以下の低いCa(2+)濃度領域で3MST/CAT経路からのH2S生産量が上昇すること、Ca(2+)による制御を受ける酵素はCATであることを示した。視細胞は明時にCa(2+)濃度が10 nM程度にまで減少することが知られており、H2S生産が明時において起こることが示唆された。

6.網膜で生産されたH2Sによる生理作用を明らかにするために、細胞内のセカンドメッセンジャーとして重要なCa(2+) 動態に着目した。マウス網膜のスライス標本を作製し、蛍光顕微鏡を利用したCa(2+) イメージングを行った。その結果、視細胞の脱分極によって起こる細胞内へのCa(2+) 流入が、H2Sの共存によって抑制されることを見出した。さらに、この抑制現象はプロトンポンプvacuolar type H+-ATPase (V-ATPase)の阻害剤によって消失した。これらの結果から、H2SがV-ATPaseを活性化してプロトン放出を促進し、視細胞-水平細胞間の酸性化を起こして電位依存性L型Ca(2+)チャネルを抑制するというメカニズムが明らかとなった。H2Sは視細胞内のCa(2+)濃度を低く保っていると考えられる。

7.眼に強い光を照射すると、視細胞が変性し細胞死を起こす。この現象を「網膜光障害」と呼び、活性酸素種による細胞内Ca(2+)上昇やミトコンドリア機能不全などが原因とされる。H2Sを外から補うことによって障害を予防できると考え、網膜光障害モデルマウスを作製して検証を行った。その結果、光照射前にマウスへH2Sを投与することにより、光障害による形態異常・細胞死・酸化ストレスによるDNA損傷が緩和された。H2Sは網膜光障害から視細胞を保護しうることを明らかにした。

以上、本論文はガス状生理活性物質H2Sを生産する3MST/CAT経路の制御因子とその分子メカニズムを明らかにした。さらに、網膜におけるH2Sの生理機能を示し、網膜光障害から視細胞を保護する作用を明らかにした。本研究は、日常光環境下での網膜におけるH2Sの生理的な役割を提唱すると共に、網膜光障害や網膜変性疾患等への予防・治療に貢献をなすと考えられ、学位の授与に値するものと考えられる。