The extensive application of DNA amplification technologies is dependent on the development of inexpensive and simplified detection and amplification systems. Cell lysis and subsequent release of genomic DNA is an ongoing dilemma for molecular biological techniques. In most cases, technologies like PCR and other amplification techniques require DNA extraction and purification steps. The Smart Amplification Process Version 2 (SmartAmp2) is an isothermal and integrated DNA amplification method that precludes the need for time consuming sample preparation for the rapid detection of single nucleotide polymorphisms (SNP), mutations, and other DNA targets. In addition, DNA amplification directly from whole blood is beneficial and lessens the risk of cross-contamination. Traditional SmartAmp2 assays entail two steps and require an alkali pretreatment step at 98℃ prior to the 60℃ run. To make SmartAmp2 truly isothermal and to simplify DNA amplification, we hereby introduce the SmartAmp Isothermal Lysis Buffer (SIL-B), a newly developed chaotropic lysis buffer that enables the simultaneous recovery and denaturation of genomic material directly from whole blood at a uniform 60℃. The improved method for isolating nucleic acids from whole blood is a critical milestone in making SmartAmp2 truly isothermal from start to finish at one temperature, increasing its potential to be routinely used in field point-of-care diagnostics. Furthermore, pretreatment with SIL-B enables the PCR amplification of genomic material directly from whole blood. This technological development may have various applications including the potential diagnosis of point mutation detection of clinical viral samples.

Vaccination is the primary form of protection from influenza virus infection. The recently developed replication-incompetent PB2-knockout (PB2-KO) influenza virus that possesses a reporter gene (the green fluorescent protein gene) in the coding region of the PB2 segment replicated to high titers in PB2-expressing, but not unmodified, cells, suggesting its potential safety and feasibility as a vaccine. I tested its efficacy in a murine model. The levels of IgG and IgA antibodies against influenza virus in sera, nasal washes, and bronchoalveolar lavage of mice immunized with the PB2-KO virus were higher than those induced by a conventional inactivated vaccine. All PB2-KO virus-immunized mice survived a challenge with lethal doses of influenza virus. Moreover, importantly, mice immunized with the PB2-KO virus produced antibodies against the reporter protein, suggesting that the PB2-KO virus has potential as a multivalent vaccine to combat infection with not only influenza virus but also of other pathogens. In summary, consistent resistance to lethal infections, modest viral titers in organ homogenates, lack of visible illness or pathology in mice, feasibility in vaccine preparation and administration, and its ability to trigger an immune response without inducing adverse reactions, are factors that strongly indicate that PB2-KO(GFP) is a safe and efficacious multivalent vaccine candidate.

本論文は、制限的増殖性インフルエンザウイルスを基にそのワクチンベクターとしての性状を解析したものである。

インフルエンザウイルスのPB2遺伝子は、ポリメラーゼサブユニットのひとつPB2をコードしており、ウイルス増殖に不可欠である。論文提出者は、その遺伝子翻訳領域の大部分をGFPレポーター遺伝子と置換することで、通常の細胞では増殖しない組み換えウイルス(PB2ノックアウトウイルス;PB2-KOウイルス)を作出した。一方、遺伝子工学的に樹立したPB2発現細胞において、このPB2-KOウイルスは効率よく増殖した。106 plaque-forming unit(PFU)のPB2-KOウイルスを経鼻接種したBALB/cマウスは、2週間の観察期間中、その体重が上昇し続けた。ウイルス接種後1、3、および6日後の肺ならびに鼻甲介中のウイルス力価を測定したが、ウイルスは検出されなかった。PB2-KOウイルス接種マウスの血清、鼻腔内洗浄液、ならびに肺洗浄液中には、ウイルス特異的なIgGならびにIgA抗体が検出された。さらにその抗体量は、概して実験対照群(培地あるいはホルマリン不活化ウイルスを接種したマウス)で検出された抗体量よりも多かった。これらの結果は、PB2-KOウイルスが、通常の条件下では非増殖性で病原性を持たない一方で、ウイルス特異的抗体の産生を効率よく誘導することを示している。

106 PFUのPB2-KOウイルスを1~3回ずつ経鼻接種したBALB/cマウスを、致死量の野生型インフルエンザウイルスで攻撃したところ、全てのマウスが生残した。特に、2回以上PB2-KOウイルスを接種したマウスは、攻撃後の体重減少も見られなかった。攻撃後3日目と6日目の肺ならびに鼻甲介中のウイルス力価を測定したところ、2回以上PB2-KOウイルスを接種したマウスの各臓器のウイルス力価は検出限界以下だった。これらの成績は、概して実験対照群のものよりも優れていた。さらに、PB2-KOウイルス接種マウスから採取した血清から、GFPレポーターに対する特異抗体が検出された。これらの結果は、PB2-KOウイルスの、ホルマリン不活化ウイルスよりも優れたワクチン効果だけでなく、多価ワクチンベクターとしての潜在性も示している。

以上、本論文において論文提出者は、PB2-KOウイルスのワクチンベクターとしての安全性、防御免疫賦与効果の高さ、ならびに多価ワクチンベクターとしての潜在性を、マウスモデルを用いて示した。本研究は、既存の弱毒生ワクチン・不活化ワクチンそれぞれが持つ短所を補った新しいタイプのワクチンを提唱するものであり、インフルエンザのみならず、さまざまな感染症への応用も期待できる。

なお、本研究は渡辺真治、桂廣亮、小澤真、ならびに河岡義裕との共同研究であるが、論文提出者が主体となって計画および解析を行ったもので、研究の完遂に十分寄与したものと判断できる。

したがって、博士(生命科学)の学位を授与できると認める。