Introduction

Physicochemical studies of single living cells are essential for molecular level in-depth understanding of life. Time- and space-resolved Raman spectroscopy, which provides detailed information on molecular structures and dynamics, is a promising powerful method for in vivo studies of living cells. Raman spectra of lipids, proteins and nucleic acids in living cells have been studied with the excitation in the 600 ~ 1000 nm wavelength range, which suffers less from the interference by the cell autofluorescence. Shorter wavelength excitation in the 400 ~ 600 nm range increases the risk of fluorescence interference but, at the same time, facilitates resonance Raman spectroscopy of hem enzymes that have strong electronic absorption bands in the visible region. Resonance Raman spectroscopy has much higher sensitivity and selectivity than ordinary (non-resonant) Raman spectroscopy, because of more than 1000 times resonance enhancement of the observed Raman band intensities.

In the present study, I have constructed a multi-wavelength excitation Raman microspectrometer using seven different laser lines in the wavelength range of 450 ~ 650 nm. The apparatus has been applied to single living cells of budding yeast, which is known as a good model of eukaryotic species. Raman spectra with different excitation wavelengths have been measured from the same spot of the same cell in order to examine the resonance Raman effect in living cells. It has been shown that multi-wavelength excitation Raman microspectroscopy enables us to image the spatial distributions of two different hem enzymes that have different resonance conditions.

Multi-wavelength excitation Raman microspectrometer

The constructed system is schematically shown in Figure 1. An Ar-Kr ion laser is used for a multi-line excitation light source in addition to a He-Ne ion laser and a laser diode green laser. The ion laser is suitable for a laser microscopic system because of its high-quality beam pattern. Seven wavelengths, 457.9, 488, 514.5, 532, 568.1, 632.8 and 647.1 nm, are available for Raman excitation in this system. A prism beam splitter (reflectance: 25 %, transmittance: 75 %) is used for introducing the excitation laser beam into the microscope. The laser beam is focused by a X100/ 1.40 N.A. oil immersion objective lens. The backward Raman scattering is collected by the same objective, passed through the beam splitter and notch/dichroic filters, and analyzed with a polychromator equipped with a CCD camera. The polychromator has a cross slit that acts as a confocal pin hole as well as an entrance slit. The use of the cross slit reduces the number of optics and therefore markedly increases the efficiency of the collecting optics. Detection efficiency becomes more critical for shorter wavelength excitation experiments, in which lowest possible excitation laser power is used for avoiding the sample damage. The spatial resolution, which depends on the excitation wavelength, is 0.3 μm in the lateral direction and 1.8 μm in the axial direction with the 532 nm line.

The resonance Raman effect in a single living cell

A tetraploid (zygote of Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces bayanus) strain of budding yeast cultured in a synthetic complete medium (glucose 2 % w/v, yeast nitrogen base w/o amino acids 0.67 % w/v, amino acids mixture drops 0.2 % w/v) has been used for studying the resonance Raman effect in a single living cell. Figure 2 shows the Raman spectra measured from the same spot (star in the inset of Fig. 2) of the same yeast cell excited with the 632.8, 532 and 457.9 nm lines. Laser power at the sample point is 7.1, 0.6 and 0.3 mW in the 632.8, 532 and 457.9 nm excitation, respectively. Although these three spectra are obtained from the same spot in cytosol, their features are completely different because of the resonance Raman effect. In the 632 nm excitation spectrum, Raman bands of proteins (1003 cm-1) and nucleic acids (785 cm-1) are dominant with no resonance enhancement of other Raman bands. On the other hand, resonance Raman bands of cytochromes dominates the 532 and 457.9 nm excitation spectra. In the 532 nm excitation spectrum, strongly enhanced bands are ascribed to cytochrome b and c. The Raman bands at 749, 1130, ~1310 and 1584 cm-1 are common to cytochrome species. The 603 cm-1 band is characteristic to cytochrome c and the 1338 cm-1 band to cytochrome b. Different resonance Raman bands are obtained at 747, 1130, 1360, 1588 and ~1620 cm-1 in the 457.9 nm excitation spectrum. Although these bands are common to cytochrome species, the intensity pattern suggests that the main contributor is cytochrome c oxidase that has a strong Soret absorption at ~445 nm1. The Resonance Raman effect in living cells enables highly selective detection of hem enzymes.

The pre-resonance effect of the "Raman spectroscopic signature of life" in yeast cells

The "Raman spectroscopic signature of life" is a strong Raman band at 1602 cm-1 that sharply reflects the bioactivity of a living yeast cell. The origin of this 1602 cm-1 band still remains controversial with an issue of possible resonance Raman enhancement. The multi-wavelength excitation Raman microspectrometer can measure the 1602 cm-1 band intensities excited with different wavelengths. Figure 3 (A) shows the Raman spectra obtained from the same spot (star in the inset of Fig. 3) of a living yeast cell excited at 632.8, 532 and 457.9 nm. All spectra show a strong band at 1602 cm-1. Figure 3 (B) shows the excitation profile (plot of Raman intensity vs excitation energy) of the 1602 cm-1 band. The small intensity enhancement on going from 632.8 nm to 457.9 nm is consistent with the pre-resonance Raman effect of the 1602 cm-1 band with an electronic absorption lying in the ultraviolet region. The multi-wavelength excitation Raman system enables us to study the pre-resonance Raman effect in a single living cell as well.

Excitation-wavelength specific Raman imaging

Spatial distributions of Raman intensities recorded with the three different excitation wavelengths have been measured by moving the sample with a piezoelectric stage on the microscope with a step of 300 nm. A singular value decomposition analysis has been used in order to increase the signal to noise ratio. Figure 4 shows the Raman images thus obtained. The images constructed by the 1445 cm-1 band (C-H bend) of lipids, which are non-resonant with 450 ~ 650 nm excitation, show similar distribution pattern for the three excitation wavelengths. The 1602 cm-1 band image shows the localization of the molecular species giving rise to this band, indicating that its spatial distribution does not appreciably change during the measurement. The 632.8 nm image at 785 cm-1 shows the spatial distribution of nucleic acids and that at 1003 cm-1 the distribution of proteins. The 603, 1338 cm-1 images obtained with 532 nm and the 1360 cm-1 one with 457.9 nm are ascribed to cytochrome c, cytochrome b and cytochrome c oxidase (with possible minor contributions from other cytochromes), respectively. Raman images of molecular species having different resonance conditions are now obtainable from the same single living cell with the use of the constructed multi-wavelength excitation Raman microspectrometer.

Conclusion

A multi-wavelength excitation Raman microspectrometer with seven different laser lines in the wavelength range of 450 ~ 650 nm has been newly constructed. The apparatus enables the comparative studies of space-resolved Raman spectra obtained from the same spot of the same living cell but with different excitation wavelengths. It facilitates the detailed analysis of the resonance effect to make Raman spectroscopy of living cells still more informative.

1T. Yonetani, J. Biol. Chem., 1960, 235 ,845-852

Figure 1. Schematic diagram of the constructed multi-wavelength excitation Raman spectrometer.

Figure 2. Raman spectra of a single yeast cell excited by 632.8, 532 and 457.9 nm at the same spot of the same yeast cell (star in the inset).

Figure 3. (A); Space-resolved Raman spectra from the same spot of a living budding yeast cell (star in the inset) with 632.8, 532 and 457.9 nm excitation; (B) excitation profile of the 1602 cm-1 band. The 1445 cm-1 band of lipids is used as an internal intensity standard.

Figure 4. Raman images of a living yeast cell with 632.8, 532 and 457.9 nm excitation. Optical microscope image of the same cell is also shown.

本論文は、生細胞の共鳴ラマン測定を行うための多波長励起顕微ラマン分光装置の開発、応用を中心に、生細胞の顕微ラマン分光について記述されており、全5章から構成される。

第1章では導入として、生細胞の分子レベルでの理解の重要性と、それに対する顕微ラマン分光法の有効性が示されている。顕微ラマン分光法による豊富な分子の情報や簡便性、非侵襲性について解説され、他のin vivo 測定法に対する利点が記述されている。一方で現状、感度の問題で検出できない微量分子種の存在にも言及している。それに対し、共鳴ラマン効果を応用することの意義が述べられている。

第2章では多波長励起顕微ラマン分光装置の開発と生細胞への応用の結果が示されている。励起波長として457.9, 488, 514.5, 532, 568.1, 632.8, 647.1 nmの使用が可能であり、様々な波長で生細胞のラマン測定が可能となる。また、457.9, 532, 632.8 nmについては高い位置再現性(面内方向: ~ 50 nm, 光軸方向: ~ 200 nm)で同一試料を励起可能となった。これにより空間分解能に対して十分な精度で、同じ空間点のラマンスペクトルを異なる励起波長により測定できることが示された。

生細胞への応用として、出芽酵母、動物細胞の測定例が示されている。457.9 nm 励起によりCytochrome c oxidaseが、532 nm励起によりCytochrome b, cが充分なS/N比で検出された。また、457.9, 532, 632.8 nmで測定されたラマンイメージが示され、各励起波長に特徴的な分子種のイメージが得られた。同時に「生命のラマン分光指標」に関して、空間分解励起プロフィールが測定され、当該バンドの前期共鳴ラマン効果の存在が示唆された。上記のとおり多波長励起によるラマン測定が既存の測定に比べ、多くの有用な情報をもたらすことが示されている。

第3章では「生命のラマン分光指標」の光褪色現象について述べられている。「生命のラマン分光指標」は生細胞の代謝活性を反映すると考えられているがその帰属は明らかとなっていない。本章では野生株に対して、呼吸欠損株の「生命のラマン分光指標」が、励起レーザー光により、光褪色を起こすことが述べられている。また、励起レーザーの強度、波長による褪色速度の依存性も検証された。これより、その帰属分子が生細胞内の過渡種である可能性が議論されている。

高い時間分解能を用いた、光褪色現象の測定では特異値分解解析による詳細な解析結果が示されている。この中で光褪色により減少するスペクトル成分が複数存在することが示されている。本章では、「生命のラマン分光指標」の帰属や生細胞内でのダイナミクスに関する知見が得られると同時に、時空間分解ラマン分光法が生細胞研究に極めて重要な手法であることが強調されている。

第4章では生細胞の同位体置換効果について述べられている。炭素安定同位体を含むグルコースを用いた実験においては、脂質とともに「生命のラマン分光指標」に明瞭な同位体置換効果が観測され、その振動モードがC=C伸縮振動に帰属されることが示されている。加えて、水素安定同位体を含むグルコースによる実験から、水素が直接結合していないC=C結合の可能性に言及し、「生命のラマン分光指標」の帰属候補として、セミユビキノンラジカルアニオンが提唱されている。

炭素安定同位体を炭素源とした出芽酵母の培養を時系列で追跡した実験では、細胞内の炭素が12Cから13Cに置換される様子が数時間の分解能のオーダーで測定された。細胞内での物質の新陳代謝の時間スケールについて議論されている。

第5章は以上の研究結果を総括している。

本研究により、多波長励起顕微ラマン分光装置が開発され、生細胞内の非共鳴分子種に加えて、共鳴効果を示す分子種の検出が可能となった。従来の測定結果に加えて、細胞の活性に関わるCytochrome種の振動スペクトル、空間分布が測定可能となったことは、生細胞の組成、動態の研究に極めて有用である。また、高い時間分解能での生細胞のラマン測定(第3章)、生細胞の同位体効果(第4章)についても生細胞のより詳細な分子レベル解析を可能とする。上記のような新規の装置、手法開発と、有効性を示す応用結果は、物理化学的手法を最大限に利用することで、生細胞の分子レベル解析に新しい方法論を開拓するという意欲のもとに展開されており、高く評価できる。

本論文第2章の一部はChemistry Letters 誌に(〓口宏夫との共著)、第3章の主要部分はJournal of Physical Chemistry B 誌に(〓口宏夫との共著)、第4章の主要部分はChemistry Letters 誌に(鳥居肇、〓口宏夫との共著)公表済みであるが、論文提出者が主体となって実験および解析を行っており、その寄与が充分であるので、学位論文の一部とすることに何ら問題はないと判断する。

以上の理由から、論文提出者小野木智加朗に博士(理学)の学位を授与することが適当であると認める。