DNA replication is a fundamental process of biological inheritance that occurs in all living organisms for the passage of their DNA to the next generation. In this process, double-stranded (ds)DNA is split into single strands so that DNA polymerase can read the template and synthesize complementary strands. This unwinding of dsDNA into two single strands is performed by a family of proteins called helicases. In Escherlchla coli, DnaB protein is the helicase that plays this crucial role. DnaB disrupts the hydrogen bonds of dsDNA, resulting in the initiation of DNA replication. The recruitment of DnaB to the origin of replication (oriC) of the genomic DNA is performed by another protein, DnaC.

In this study, the initiation of replication by DnaB and DnaC is studied from the point of view of the molecular structure. The crystal structure of DnaCn-bound DnaBc is reported here (Fig. 1.) and provides the first insight into the binding and the release of DnaC and DnaB.

The crystal structure of the DnaBc-DnaCn complex shows that two helical regions in DnaCn are important for its binding to DnaB. The first helical region (CnHelixl) lies on one side of two alpha helices (BcHelixl' and BcHelix6) of neighboring DnaBc proteins. CnHelixl, BcHelixl', and BcHelix6 play a key role in DnaC release on DnaG binding to DnaB. The second helical region (CnHelix2) has a longer helix than CnHelixl and is present on one side of one DnaBc protein, thereby making contact with only one DnaBc molecule per CnHelix2. Thus, by solving the crystal structure of the DnaBc-DnaCn complex the mechanism of DnaB and DnaC binding was elucidated.

To confirm the mechanism of complex formation, additional mutagensis analysis of the crystal structure of the DnaBc-DnaCn complex was conducted. An earlier random mutational analysis study of DnaC had shown that the mutations of residues mainly in CnHelix2, located close to DnaBc, decreased the binding affinity of DnaB for DnaC. An additional mutational analysis was conducted for the CnHelixl residues and some CnHelix2 residues that were considered to be in contact with DnaBc in DnaBc-DnaCn structure thus confirming the crystal structure of DnaBc -DnaCn is likely to be the structure in the DnaB-DnaC complex.

DnaBc ATPase activity against the DnaBc-DnaCn structure is also discussed. The structure revealed that ATPase site of DnaBc consists of Walker A and Walker 13 motifs, which is a classicial ATP binding motif among DnaB proteins. DnaCn binding to DnaBc did not seem to cause a structure change in DnaBc that causes the deficiency in ATP binding. This does not contradict the fact that DnaC-ATP complex inhibits the ATPase activity of DnaB but DnaC-ADP. That is, ATPase domain of DnaC is located in DnaCc whereas the domain solved in the crystal structure of this study was DnaCn. Therefore, DnaCn will not itself bind to ATP and hence it can be assumed that DnaBc-DnaCn will be an ATPase active form of DnaB, which was seen in the crystal structure of DnaBc-DnaCn.

Furthermore, small-angle X-ray scattering (SAXS) analysis for DnaC, DnaB, and the DnaB-DnaC complex was conducted. SAXS results for DnaC revealed that DnaC in solution exists in a conformation such that DnaCn and DnaCc are divided by a linker region. Hence, it is suggested that the structure of DnaC changes in the linker region of DnaCn and DnaCc, allowing the DnaC complex to bend in a hinge motion and place DnaCn beside DnaBc hexamer and DnaCc below DnaBc hexamer (opposite to DnaBn). Overall, our study of DnaB and DnaC structures presents the first insight into the initiation of replication mediated by these two proteins.

Fig 1. The overall structure of DnaBc and DnaCn in stereo view. DnaCn is shown in magenta, DnaBc is shown in blue to red from its N-terminus to C-terminus. DnaCn alpha helices are labeled in pink, DnaBc alpha helices are labeled in green, and DnaBc beta sheets are labeled in cyan.

本論文は4章からなる。第1章はイントロダクションであり、これまでの研究や関連分野の研究における課題についてまとめてある。本論文で取り扱うDnaBはDNA複製において、DNAを二本鎖から一本鎖に解離するタンパク質であり、DnaCはDnaBを反応起点へと運ぶタンパク質である。どちらもDNA複製に大きく関与しており、大変重要なタンパク質である。DnaBは全長構造が3種の異なる種由来で現在までに得られているが、機能解析において大腸菌をモデルとした実験が多く進められているにも関わらず、大腸菌での構造はDnaBのN末ドメイン(DnaBn)しか解明されていなかった。一方で構造が解かれていないほうのドメインである、DnaBのC末ドメイン(DnaBc)がDnaCのN末ドメイン(DnaCn)との相互作用に重要なことが変異体解析から判明していた。このような背景をふまえて、本論文ではDnaBcとDnaCn複合体のX線結晶構造解析を行っている。論文提出者はDnaBcとDnaCnの複合体の構造を解明し、DnaBとDnaCの相互作用及び、それらの複製においての機能について、分子レベルで明らかにすることを目的としている。関連分野の研究の背景を踏まえた上でも、価値のある研究テーマを設定したと評価できる。

第2章は実験方法について述べられている。方法については詳細に述べられており、論文提出者がきちんと計画を練って行ったと評価できる。また、論文提出者がX線結晶構造解析について十分な知識を持って研究を遂行したと考えられる。さらにDnaBcとDnaCnの複合体結晶を得るまでに様々な条件検討を行っており、論文提出者が大学院の過程の中で熱心に研究を行ったことがうかがえる。

第3章は実験結果になっており、DnaBcとDnaCnの複合体の結晶構造を解明し、DnaBcとDnaCnの構造や相互作用について述べられている。過去の研究と本研究で行った相互作用解析の実験から、DnaBcとDnaCnの複合体構造が妥当であることを示しており、更にDnaB、DnaCnの推定六量体モデルの構築を過去の類似タンパク質との比較から行っている。

第4章は考察になっており、DnaBcとDnaCnの構造からDnaBの推定六量体形成や、DnaCが六量体の中でどのように結合しているかについての予測を行っている。またその結果からDnaGがDnaCを解離する一因について述べられているが、こちらについては考察が不十分な点も認められたので、論文上の改訂を促した。また追加としてDnaBcのATPase活性への更なる考察も促した。

本論文で解明されたDnaBcとDnaCnの結晶構造は大腸菌由来のものとしては初めてであり、また、DnaBcとDnaCnの相互作用を立体的に見たのはどの種でもこれが初めてである。この結晶構造から得られたDnaBとDnaCの相互作用やDNA複製におけるこれらの構造的知見はDNA複製のメカニズムの理解を大きく進展させるものであり、今後本論文の内容から、関連分野の研究が発展していくと期待される。

なお、本論文第2章は、九州大学植田正教授、崇城大学大栗誉敏准教授との共同研究であるが、論文提出者が主体となってタンパク質の発現・精製を行ったもので、論文提出者の寄与が十分であると判断する。

したがって博士(理学)の学位を授与できると認める。