The dopamine system is involved in motor function, mood, motivation, reward and so on. Synaptic dopamine level is tuned by dopamine transporter (DAT) which is one of the main targets of several psychoactive drugs. A functional genetic polymorphism has been described in the 3'-untranslated region (UTR) of exon 15 in DAT (Figure). This 3'-UTR contains a 40-bp long variable number of tandem repeats (VNTR) domain. The polymorphism within this region is known to be associated with neuropsychiatric disorders such as ADHD, PD, alcoholism and drug abuse, and with modified gene expression depending on the genotype in vivo and in mammalian cell lines. In my Master thesis and our previous study, we demonstrated that HESR1 and HESR2 reduced the DAT reporter gene expression.

In this study, I tried to clarify following two topics, (1) Discovery of the behavioral function of the Hesr1 and Hesr2, (2) Molecular characterization of HESR1 and HESR2 focusing on its cis-element and co-factor. For (1), first, I investigated localization of the Hesrs in mice brain and next, screened altered behavior in the knockout (KO) mice comparing with the wild type mice using series of behavioral test battery. For (2), I conducted luciferase reporter assay with DAT reporter gene and its deletion constructs to identify HESR-responsive elements in the neuroblastoma. At the same time, I tried to detect HESRs-androgen receptor (AR) interaction affecting DAT gene expression because HESR1 was reported to be a co-repressor for the AR in a study of prostate cancer. In addition, sexual dimorphisms in dopamine-related function and expression of the DAT are reported.

As a result, I found the following: (1) Localization of Hesr1 and Hesr2 in dopaminergic neurons was detected in mice midbrain by immunohistochemistry and enhanced prepulse inhibition (PPI) was observed in the Hesr1 KO mice. In the presence of prepulse, it is widely known that startle response to strong sensory stimulus is inhibited comparing with the case without prepulse. In other words, prepulse makes organisms less startle. It is also reported that schizophrenia patients exhibit lower PPI, suggesting that they have deficits in an operational measure of sensorimotor gating. This lower PPI in the patients can be rescued by dopamine receptor antagonists. So, I conducted PPI test again after injection of dopamine agonist to the mice. Then, the injection of agonist reduced the enhanced PPI in the KO mice and the dose dependent sensitivity to the agonist differed between wild type and KO mice. We also determined the DAT expression level of the KO mice by Western blotting after behavioral tests. There was no difference in expression level between the wild type and KO mice though the mRNA of DAT in the KO mice postnatal day 0 was up-regulated in our previous study. These things suggest that Hesr1 modulates DAT expression in developmental stage and it affects sensitivity to dopamine and sensorimotor gating in adults. (2) The deletion of the VNTR domain increased reporter gene expression, suggesting that the VNTR has an inhibitory role for DAT expression and is responsive to HESRs. The activities of luciferase reporter with 10 repeats allele which is most common in population was decreased in the presence of the HESR1 or HESR2 expressed transiently while slightly increased in the presence of the AR. Furthermore, when the HESR1 or 2 and AR were co-expressed, the inhibitory effect of HESRs became larger. Some functional modification is thought to occur when the HESRs and AR are coupled.

Thus, My data suggest suggests that expression of Hesr1 could have influence to the dopaminergic system including sensorimotor gating in physiological level. However, knockout methods are useful but sometimes give rise to artificial condition. We should search for the events where expression or function of HESRs can be modified depending on some behavioral context such as hormonal change. Relation of the VNTR of DAT and HESRs need to be investigated by context dependent manner.

Figure. Structure of 3'-UTR in DAT1 gene. (A) The genomic structure of human dopamine transporter (DAT1) gene. The coding region(closed box), non-coding region (open box), VNTR domain, and constant parts of the repeat units (gray box) are shown. Exon 15 of DAT1 contains a stop codon (arrowhead) and polyadenylation signal (open arrowhead). Upstream of the VNTR domain are six nucleotides (AATAAA) that resemble a polyadenylation signal. The allelic variants of the VNTR indicate the repeat unit type (A)-(I) for each allele. (B) Nucleotide sequence of each unit of the VNTR polymorphism in the 3'-UTR of DAT1.

本論文は、Introduction、Materials and Methods、Results、Discussion、General Discussionの6章からなる。麻薬の標的でもあり、ヒトと動物の報酬や情動、認知機能に深く関与するドーパミン神経系、特にドーパミントランスポーター(DAT)がどのような因子によって調節を受け、行動機能に変化が生じるかということの解明を目指した。ヒトのDAT遺伝子エクソン15の3'非翻訳領域(UTR)には類似した約40塩基を1単位とする繰り返し配列の多型(VNTR)が存在することが知られており、この多型と精神疾患および発達障害に対する相関研究が多くなされているが、この多型がどのような機構を介して精神疾患や気質に影響するのかといったことは全く未知であった。

論文提出者は修士課程においてHesr1およびHesr2というタンパク質がこのDAT・3'UTRを介してDAT発現を抑制する可能性を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いて示した。博士課程においては、in vivo でHesr1やHesr2がドーパミン神経系を介しどのような行動に影響を持つのかを明らかにすることを目的とした。

まず、マウスの脳を用いて免疫組織学的な解析を行い、Hesr1とHesr2のタンパク質が、殆ど全てのドーパミンニューロンに発現していることを示した。次に、Hesr1とHesr2のノックアウト(KO)マウスを用いて10種類の行動解析を行い、その結果、プレパルス抑制(PPI)という感覚機能の変化を確認した。さらにドーパミンアゴニストを用いてPPIを調べると、PPIに対する用量依存的な効果に、野生型とKOで違いが見られた。つまり、アゴニストへの感受性が変化していた。PPIは統合失調症患者やそのモデルマウスで低下し、ドーパミンが関与することが知られており、このことからもHesr1がドーパミン神経系で働いている可能性が考えられた。論文提出者は、DAT発現をHesr1が調整し、DAT発現に変化が起きた結果、Hesr1KOマウスではアゴニストへの感受性が変化したのではないかと考え、KOマウスの脳を用いてDATタンパク量を調べた。しかしながら、野生型との間で有意な違いはなかった。先行研究でHesr1KOマウスの出生日のDAT mRNA量はKOで有意に上昇していたという結果から考えると、発生段階におけるDAT発現変化の影響も考えられるが、審査会では、Hesr1が発現量を変える他の標的遺伝子についても今後調査する必要性があること、マウスにはヒトと違う機序が存在する可能性も指摘された。いずれにせよ、Hesr1がドーパミン神経系の機能を調節し、PPIに代表される認知機能、感覚調節機能に影響を与えている可能性を示したことは、新規の事実である。

さらに、論文提出者は、Hesr1およびHesr2が遺伝子発現を調節する分子機構を理解するため、DAT・3'UTRの中で、どのDNA配列がHesr1に応答をするのかを、いくつかのドメインを欠損させたDATレポーター遺伝子を用い、ヒト神経芽細胞の培養系で調べた。また、Hesr1の機能がどんな状況で変化するのかを調べるため、Hesr1の結合因子として知られるアンドロゲン(男性ホルモン)受容体との相互作用を同様の実験系を用いて調べた。その結果、VNTR領域がHesr1と2に応答し、DAT発現に対し抑制的に働くこと、Hesr1やHesr2がアンドロゲン受容体と相乗的にDATレポーター遺伝子発現を抑制することを示した。DAT発現は雄で低く、雌で高いことが知られており、上記のHesrとアンドロゲン受容体の相互作用は、この性差形成の分子機序の一つであることが示唆される。

論文提出者はHesr1遺伝子を欠損したマウスでドーパミンが関与する感覚・認知機能の変容があること、Hesr1およびHesr2とアンドロゲン受容体の協調は相乗的DAT遺伝子発現抑制効果を持つことを新規に発見した。以上のことは、これまで一般的な神経発生の因子としられてきたHesrファミリーが精神機能の発達に関与する可能性、また、それら精神機能やその背景にある分子動態に性差が生じる機序の一端を独自に示したものと考えられる。

本論文は、全般にわたり石浦章一教授との共同研究で、マウスの行動解析は国立遺伝学研究所発生工学研究室および同研究所マウス開発研究室との共同研究であるが、動物と機材の提供以外の部分は全て論文提出者自身が実験と解析及び検証を行ったもので、論文提出者の寄与が十分であると判断する。

したがって、博士(理学)の学位を授与できると認める。