In eumetazoan embryogenesis, positional information plays a central role to establish the basic body plan. Morphogens are defined conceptually as the molecule that gives positional information to cells in a concentration dependent manner. The peptide growth factor Wnt has been postulated to be a morphogen in both vertebrate and invertebrates. However, extracellular behaviours of Wnt ligands, including diffusion, distributions and signalling ranges, and their status on signal reception have remained unclear.

In Chapter I, I show the regulation of distributions and signalling ranges of Wnt by secreted Frizzled-related proteins (sFRPs), which are supposed to negatively modulate Wnt signalling. Although Wnt proteins are thought to diffuse extracellularly and act as morphogens, little is known about the diffusibility of either Wnts or sFRPs. Here I show that Frzb and Crescent (Cres), members of the sFRP family, have the ability to regulate diffusibilities and signalling areas of Wnt ligands, Wnt8 and Wnt11. I found, using the Xenopus embryo, that Wnts do not appear to diffuse effectively, whereas Frzb and Cres spread very widely. Interestingly, Frzb and Cres substantially promoted the diffusion of Wnt8 and Wnt11 through extracellular interactions. Importantly, I show that Wnt8 conveyed by sFRPs can activate canonical Wnt signalling despite the molecular nature of sFRPs as a Wnt inhibitor, suggesting a novel regulatory system for Wnts by sFRPs.

In Chapter II, I aim to elucidate cellular and molecular mechanisms underlying the expansion of the distribution and signalling range of Wnt by sFRPs. I show that the general principle for extracellular distribution of secreted proteins is "binding to cells." by using a newly invented methods, named antibody-based ligand trapping (AbLT). Based on this principle, I demonstrate that most of the secreted Wnt8 and Frzb proteins are bound to the cell surface or extracellular matrices (ECMs), by measuring their dynamics in the extracellular space using fluorescence decay after photoconversion (FDAP) and fluorescence correlation spectroscopy (FCS). Therefore, I address what is the molecular entities that bind and hold Wnt8 and Frzb in the extracellular space. It has been known for many years that heparan sulphate (HS) proteoglycans modulate Wnt distribution and are required for signal reception and transduction. However, their molecular structures and fine distribution on the cell surface have never been considered in the context of Wnt distribution and signal reception. Here I show that newly identified "heparan sulphate nanostructures (HSNSs)" regulate extracellular distributions of Wnt ligands and act as a preexisting core structure for the formation of Wnt/Dishevelled/GSK3 signalosomes, which is previously reported to be endosomes necesary for signal tranceduction. The data shows that two types of HSNSs have differential specificities of molecular interactions with Wnt and sFRP proteins; that is, Wnt8 co-localises with N-sulpho HSNSs, which is internalized as a core of signalosomes, whereas Frzb co-localises with N-acetyl HSNSs, which relatively stay on the cell surface. Furthermore, with co-expressed Frzb, Wnt8 turns out to preferencially co-localise with N-acetyl HSNSs, similar to Frzb, leading to expansion of Wnt distributions. These data clearly show the integration of ligand distribution and signal reception.

Thus, in this thesis study, which had started from my initial finding of range expansion of Wnt by sFRPs, I have elucidated the regulation of extracellular distribution and signal reception of the Wnt morphogen, as well as the general principle of extracellular distribution of secreted proteins.

本論文は二部構成で、要旨、全体の序論、第一部と第二部、方法、全体の考察、結論、文献からなり、第一部と第二部については、それぞれ序論、結果、考察、図表からなっており、Wnt モルフォゲンの細胞外分布とシグナル受容の制御について解析した結果を述べている。

多細胞生物の発生において、細胞運命決定やパターン形成を適切に制御するためには、位置情報が必要と考えられ、「モルフォゲン説」は有力なモデルである。分泌性シグナル蛋白質のWnt はその代表例であり、特に脊椎動物の初期発生では後方化のパターニングに関わる。一方、分泌性のWnt 結合蛋白質のsFRP(secreted Frizzled-related protein)は前方の予定頭部領域で発現する。これまでWnt とsFRP は互いに逆方向の濃度勾配を作ることで前後軸パターニングを制御すると考えられてきたが、それらの蛋白質の分布はほとんど知られていなかった。本論文の第一部では、アフリカツメガエル(Xenopuslaevis)初期胚を用いて検討することで、sFRP の分布が広い一方、Wnt の分布は狭いことを明らかにし、さらにsFRP にはWnt の分布及びシグナル範囲を拡大する活性があることを初めて示した。これらの内容は既に国際誌上で公表されており、国際的に高く評価されている。第二部では分泌性蛋白質の細胞外分布の条件を明らかにし、その基礎となるヘパラン硫酸(HS)の微小構造を発見した。これがWnt の細胞外分布を制御することを示すとともに、同時にシグナル受容の制御にも関わることを初めて示した。これらの研究成果は極めて高く評価できる。詳細は以下の通りである。

第一部ではまず、sFRP ファミリーのFrzb、Crescent(Cres)、およびWnt8 とWnt11について、蛍光蛋白質Venus との融合コンストラクトにより、Xenopus 胚でのそれらの蛋白質の分布を検討した。その結果、Frzb とCres は分布が広い一方、Wnt8 とWnt11は分布が非常に狭いことを見いだした。sFRP はWnt と細胞外で結合することが知られているので、sFRP を共発現させて、Wnt の分布を検討したところ、相互の結合特異性に応じてWnt の分布が広がることを発見した。これが本研究の発端となっている。さらに、これまでWnt の阻害因子と考えられていたsFRP が、Wnt のシグナル範囲を広げ得ることをLuciferase レポーターアッセイや内在性のotx2 の発現で明らかにした。さらに、内在性のFrzb とCres の発現をantisense morpholino oligo(MO)を用いて阻害したときに、内在のWnt のシグナル勾配が、MO 注入胚ではコントロール胚よりも急になることから、実際にsFRP がWnt のシグナル範囲拡大に寄与していることが示唆された。sFRP のような分泌因子によるWnt の分布やシグナル範囲の制御はこれまでに無い、全く新しい知見である。

第二部では、Wnt8 とFrzb の細胞外分布の様式に着目した解析を行った。まず、光変換型蛍光蛋白質mKikGR を用いたfluorescence decay after photoconversion(FDAP)法を応用することで脊椎動物胚では初めて、細胞外蛋白質の「見かけの拡散係数」を計測することに成功した。重要なことに、得られたWnt8 とFrzb の見かけの拡散係数は、分子量から予想される値よりも著しく小さく、これらの分泌性蛋白質の大部分が細胞表面や細胞外基質に結合していることが示唆された。また蛍光相関分光(FCS)法でもmVenus-Wnt8 の細胞外での挙動を解析し、これまでその整合性が十分理解されていなかったFDAP 法とFCS 法の特性が明らかになった。この知見に加え、内在性の物質と相互作用しないと考えられる人工の分泌性蛋白質SP-mVenus は細胞間隙には検出されないが、ヘパリン結合ペプチドを融合することで、細胞間隙に分布することを見いだした。さらに抗体を人工レセプターとして用いる「抗体トラップ法」を開発し、これにより分泌性蛋白質が細胞間隙に分布することは細胞に結合することに他ならない、という一般原理が初めて示された。次に結合の分子実体を探った。mVenus-Wnt8 とmVenus-Frzb は、Xenopus 胚の細胞間隙にドット状あるいは不均一な分布を示した。そこで、ヘパラン硫酸(HS)分解酵素を用い、内在のHS を分解した条件下で、Wnt8 やFrzb の分布を検討し、また内在のHS の分布を免疫染色で検討した。その結果、N-acetyl HS 及びN-sulphoHS が細胞間隙にドット状の微小構造を形成していることを見いだし、HS nanostructure(HSNS)と名付けた。この構造はヒト由来のHeLa 細胞にも見いだされた。さらにWnt8は主としてN-sulpho HS に、Frzb は主としてN-acetyl HS の微小構造に結合することを明らかにした。Wnt は細胞内に取り込まれて、いわゆる「シグナロソーム」を形成するが、これにN-sulpho HS が含まれていることを示したことで、Wnt のシグナル受容はN-sulpho HS の微小構造が「シグナロソーム」の核となることを初めて明らかにした。

以上のように種々の手法を考案しつつ、またFDAP のような定量的手法と数理的解析を取り入れた上で、分子レベルでWnt モルフォゲンの細胞外での制御を解明した本研究は高く評価できる。

なお、印刷公表予定の論文中のFDAP 法及びFCS 法の解析の一部は共著者の望月敦史博士や佐甲靖志博士らによるものであるが、本論文に記載されている解析は全て論文提出者が主体となって分析および検証を行ったものであり、論文提出者の寄与が十分であると判断する。

したがって、博士(理学)の学位を授与できると認める。