The stress response, which can trigger various physiological phenomena, is important for living organisms. For instance, a number of stress-induced granules such as P-body and stress granule have been identified. These granules are formed in the cytoplasm under stress conditions and are associated with translational inhibition and mRNA decay. In the nucleus, there is a focus named nuclear stress body (nSB) that distinguishes these structures from cytoplasmic stress granules. Many splicing factors and long non-coding RNA species localize in nSBs as a result of stress.

tRNA is a primitive short non-coding RNA. Indeed, tRNAs respond to several kinds of stress such as heat, oxidation or starvation. Although nuclear accumulation of tRNAs occurs in starved Saccharomyces cerevisiae, this phenomenon is not found in mammalian cells. We observed that initiator tRNA(Met) (Meti) is actively translocated into the nucleus of human cells under heat stress. During this study, we identified unique granules of Meti that overlapped with nSBs. Similarly, elongator tRNA(Met) was translocated into the nucleus and formed granules during heat stress. Formation of tRNA granules is closely related to the translocation ratio. Then, all tRNAs may form the specific granules.

Additionally, there are also several functional domains in unstressed nucleus. Nuclear speckles are a one of the domains. Long non-coding RNA MALAT-1 is localized to nuclear speckles despite its mRNA-like characteristics. Here we report the identification of several key factors that promote the localization of MALAT-1 to nuclear speckles and also provide evidence that MALAT-1 is involved in the regulation of gene expression. Heterokaryon assays revealed that MALAT-1 does not shuttle between the nucleus and cytoplasm. RNAi-mediated repression of the nuclear speckle proteins, RNPS1, SRm160 or IBP160, which are well-known mRNA processing factors, resulted in the diffusion of MALAT-1 to the nucleoplasm. We demonstrated that MALAT-1 contains two distinct elements directing transcripts to nuclear speckles, which were also capable of binding to RNPS1 in vitro. Depletion of MALAT-1 represses the expression of several genes. Taken together, our results suggest that RNPS1, SRm160, and IBP160 contribute to the localization of MALAT-1 to nuclear speckles. These results show that MALAT-1 could be involved in regulating gene expression.

本学位論文は、ヒトがん由来培養細胞内における非翻訳RNAの細胞内動態についてまとめられたものであり、大きくは題名、目次、略語、要旨、序論、二つの章、議論、謝辞、図と図の説明、文献から構成されている。各々の章も、序論、実験方法および材料、結果、議論からなる。

第1章においては、熱ストレスをかけられたヒトがん由来培養細胞で、70~80baseほどの短塩基長の古典的な非翻訳RNAであるtRNAのうち、翻訳開始に必須である開始コドンの役割を持つtRNA(Met)が細胞質から核に積極的に移行し、かつ特異的なグラニュ-ルを形成することを論文提出者が世界で初めて発見したという知見について述べられている。tRNAは核内で転写によって作り出され、核から細胞質へ移行し、細胞質内でアミノ酸をリボソ-ムへ運ぶことにより翻訳に寄与するということが一般的な事柄である。近年、tRNAは核から細胞質への一方通行ではなく、核-細胞間をシャトリングしうるということがわかってきており、種々のストレス存在下では、tRNAが核へ積極的に集まるような現象が確認されてきている。論文提出者は熱ストレスをヒトの培養細胞にかけることでtRNA(Met)が積極的に核へ移行し、それに伴い核内でグラニュ-ルを形成するということを見いだした。熱ストレスによるtRNAの局在変化の報告はこれまでに全くなく(特にヒトにおいては)、この研究成果自体が極めて斬新なものであると考えられる。また、がんの治療法の一つに、がん組織に熱を加えることでがんを治療するという温熱療法があるが、詳細なメカニズムはまだ解明されていない。第1章の現象がこの温熱療法のメカニズムの一端を担っている可能性、例えば、tRNA(Met)は翻訳開始に必須であるので、これらが核に積極的に移行することにより翻訳抑制を起こすことでがん細胞を死滅させるという新規メカニズムモデルを提案できることから、臨床医学的な見地からも大変有意義であると思われる。この第1章の研究成果は国際誌「Biochemical and Biophysical Research Communications 418 (2012) 149-155」に掲載されている。

第2章においては、ヒトがん由来細胞において、長塩基長のmRNA様の非翻訳RNAであるMetastasis associated in lung adenocarcinoma transcript-1 (MALAT-1)がほ乳類の核内構造体の一つである核スペックルに局在するメカニズムを新たに見いだしたという知見について述べられている。MALAT-1は肺がんを含めた種々のがんにおいて高発現していることがこれまで報告されてきているが、機能についてはまだよくわかっていない。また、MALAT-1は核スペックルと呼ばれる核内構造体に局在していることもわかっているが、その生理的意味、局在様式は不明であった。論文提出者は、未知であるこの局在様式の解析、また、この局在が関わる生理機能の解明に着手した。その結果、MALAT-1が核スペックルに局在するために必要なMALAT-1自身の領域、及び、必要な核スペックル内のタンパク質因子複合体の同定に成功し、このMALAT-1と核スペックルタンパク質とを結びつける直接的相互作用もin vitroレベルで確認できた。さらに、MALAT-1の核スペックルへの局在が関わる生理現象を予見できるような結果も得ている。この研究成果は機能未知であったMALAT-1の機能を決めるための重要な成果であると評価できる。これまでに、MALAT-1はがんマ-カ-として有用であるとの報告もあるので、この研究成果は、ほとんどがタンパク質やDNAに焦点をあてた既存のがん治療と異なり、非翻訳RNAであるMALAT-1という新しい生体分子をタ-ゲットにした新たながん治療の開発へとつながる可能性を秘めており、臨床医学的見地からも大変意義深いものと考えられる。この第2章の研究成果は国際誌「RNA」に採択され、現在印刷中の状態である。

なお、本論文第1章は、水野利恵、渡邉和則、井尻憲一との共同研究、また、第2章は、田埜慶子、水野利恵、中村陽、廣瀬哲郎、前田明、増尾好則、柴藤淳子、Randeep Rakwal、秋光信佳、井尻憲一との共同研究であるが、どちらの章の研究成果も論文提出者が主体となって実験、分析および検証を行ったもので、論文提出者の寄与が十分であると判断する。したがって、論文提出者は博士(理学)の学位を授与できるに相応しいと認める。