In the field of Evolutionary Developmental Biology, it remains unsolved as to how the gastrula organizer evolved from its ancient prototype in eumetazoans. To address this issue, I investigated gene regulatory mechanisms in the organizer of various organisms by focusing on organizer-specific transcription factors.

The LIM homeobox gene lim1 (lhx1) is specifically expressed in the vertebrate gastrula organizer, and Lim1 acts as a transcriptional activator to exert 'organizer' activity in Xenopus embryos. Its ancient paralog, lim3 (lhx3), is expressed around the blastopore in amphioxus and ascidian but not vertebrate gastrulae. These two genes are thus implicated in organizer evolution. In Chapter I, I addressed the evolutionary origins of their blastoporal expression and organizer activity. Gene expression analysis of organisms ranging from cnidarians to chordates suggests that blastoporal expression has its evolutionary root in or before the ancestral eumetazoan for lim1, but possibly in the ancestral chordate for lim3. Analysis of organizer activity of Lim1 and Lim3 from various organisms using secondary axis forming assays in Xenopus embryos suggests that activation of Lim1 by its co-factors, Ldb and Ssbp, is evolutionarily conserved in eumetazoans, and that Lim1 acquired organizer activity in the bilaterian lineage, whereas Lim3 acquired organizer activity in the deuterostome lineage. In addition, ascidian Lim3 acquired a specific transactivation domain to confer organizer activity on this molecule. Gain and loss of function analyses using cnidarian embryos suggest that Lim1 has organizer activity in cnidarian embryos by regulating expression of blastoporal genes such as chordin and foxa, depicting the evolutionary origin of the organizer.

In vertebrates, homeodomain proteins Otx2 and Lim1 are required for head formation, but the regulatory principles underlying their functions in the head organizer remain unsolved. In Chapter II, I show using ChIP-seq analysis that Otx2, Lim1, the coactivator p300 and the corepressor TLE/Groucho colocalize on cis-regulatory modules (CRMs) of thousands of genes including almost all 'head-organizer' genes in the Xenopus tropicalis gastrula. Comprehensive analysis of CRMs with RNA-seq data revealed that Lim1/Otx2-bound CRMs co-localizing with TLE rather than p300 are strongly associated with region/tissue-specific genes. Together with reporter analyses, my data suggest that Otx2 activates head-organizer genes with Lim1 and represses non-head-organizer genes with transcriptional repressors such as the head-organizer specific homeodomain protein Goosecoid (Gsc). Furthermore, ChIP-seq analysis for Gsc and histone modifications supported this regulatory model. Thus, it is likely that each of thousands of genes interprets Otx2 as a 'positional tag' to determine its expression in the head organizer, corroborating the idea that positional information directly contributes "massively parallel (distributive) gene regulation."

In cephalochordates (amphioxus), the notochord runs through the dorsal side and reaches the anterior tip of the body. It is reported that gsc is not expressed in the head but expressed in the notochord. This fact suggests that the change in the expression pattern of gsc led to the acquisition of the vertebrate-type head. However, the molecular mechanism of the head organizer evolution involving gsc has never been elucidated. In Chapter III, I show the conservation and diversification of gene regulation through CRMs for gsc, lim1 and chordin between amphioxus and vertebrates. The data suggest that the regulation of lim1 by Nodal signal and that of chordin by Lim1 are evolutionarily conserved in chordates but the regulation of gsc by Lim1 and Otx are not conserved in amphioxus. Furthermore, the 5' region of amphioxus gsc recapitulated amphioxus-like posterior expression of the reporter gene in transgenic reporter analyses with the Xenopus embryo. Therefore, I propose a model, in which evolution of CRMs for gsc occurred in the vertebrate lineage, resulting in inhibition of trunk genes and the formation of the head organizer and its derivative prechordal plate.

Thus, my study sheds light on the molecular mechanism of evolution of the gastrula organizer in eumetazoans.

本論文は三章構成でそれぞれの序論、方法、結果、考察、図表、および全体の要旨、序論、結論、文献からなっており、真正後生動物における原腸胚オーガナイザーの進化について、転写制御ネットワークに注目した進化発生学的な研究の結果を述べている。

真正後生動物の初期発生において、原腸胚オーガナイザーは初期原腸胚の原口唇に位置し、原腸形成から体軸形成にいたる基本的ボディプラン構築を担う。両生類の原腸胚オーガナイザーは特にシュペーマン・オーガナイザーと呼ばれ、移植によって二次胚を誘導することから、これまで多くの研究がなされ、オーガナイザー特異的遺伝子が多数同定された。またそれらの遺伝子について他の後生動物でも同定され解析されてきた。しかし、脊椎動物の原腸胚オーガナイザーにおける遺伝子制御ネットワークがどのように進化してきたかについて、それを実証的に示した研究はほとんどない。本研究はオーガナイザーの進化過程について、転写因子Lim1/Lhx1、Lim3/Lhx3、Otx2、Gsc の機能および制御機構に注目し、種々の動物群の胚、遺伝子、ゲノムを用いて広く解析したものである。解析の結果、刺胞動物でもLim1 の制御軸の一部は保存されていること、Otx2が脊椎動物の頭部オーガナイザーにおいて、多数の頭部遺伝子と胴部遺伝子を並列に正と負にそれぞれ制御すること、ナメクジウオgsc の発現制御機構は脊椎動物と大きく異なることなどを明らかにした。これはオーガナイザーの進化の分子メカニズムを初めて実証的に示したものであり、高く評価できる。詳細は以下の通りである。

第一章では、刺胞動物のlim1 遺伝子のクローニングと発現解析、および刺胞動物Lim1タンパク質の脊椎動物胚および刺胞動物胚での詳細な機能解析が示されている。その結果、lim1 遺伝子が刺胞動物の原口唇領域に発現すること、Lim1 が刺胞動物胚でオーガナイザー遺伝子として機能すること、一方で脊椎動物胚におけるLim1 による二次胚誘導能の活性は、左右相称動物の系統で進化したことが示めされた。さらに、Lim1 の古代パラログLim3 タンパク質も、新口動物の系統で進化し、脊椎動物胚での二次胚誘導能の活性を獲得していること、脊索動物の祖先種でLim3 が原口で発現するようになり、オーガナイザーの進化に寄与した可能性が示唆された。このような発現とタンパク質機能の両面から見た進化発生学解析結果は、全く新しい知見である。

第二章では、頭部オーガナイザーにおけるLim1、Otx2、Gsc の転写制御ネットワークの全容を明らかにするため、転写活性化補助因子p300、転写抑制補助因子TLE、ヒストン修飾マーカーのH3K4me1 とH3K27ac と共に、ツメガエル胚におけるChIP-seq解析について述べられている。この解析に加え、切り出したオーガナイザー領域や、機能阻害胚を用いたRNA-seq 解析による発現プロファイル解析も行うことで、オーガナイザー特異的転写因子が結合して機能するシス制御モジュール(CRM)の特徴が明らかになった。その特徴とは、Otx2 がLim1 と協調的に特定のCRM(Lim1 結合モチーフをもつ)を介して多くの頭部遺伝子を活性化する一方で、Gsc と協調的に別のCRM(Otx2/Gsc 共通の結合モチーフをもつ)を介して多くの胴部遺伝子を抑制するというものである。注目すべきは、左右相称動物で共通して頭部で発現するOtx 遺伝子が、非常に多くの標的遺伝子を並列に正と負に制御していることであり、この制御原理が頭部進化の分子的基盤になっているという進化モデルが提唱された。

第三章では、祖先的な脊索動物と考えられるナメクジウオにおけるlim1、chordin、gsc遺伝子の制御機構の解析を基に、頭部オーガナイザーの進化ついて述べられている。特に、脊椎動物では頭部オーガナイザーに発現するgsc が、ナメクジウオでは反対に後方中胚葉に発現していることに注目している。ナメクジウオのlim1、chordin、gsc のCRMの解析の結果、lim1、chordin のCRM は脊椎動物と保存されているものの、gsc のCRMが保存されていないことを見出した。レポーター実験においてナメクジウオgsc のCRMが、ツメガエル胚でナメクジウオでの発現パターンを再現したのは興味深い結果である。これらの結果を基に、Gsc が頭部オーガナイザーにコオプションすることで脊索前板が獲得され、脊椎動物型の頭部を形成するような遺伝子制御ネットワークが完成した、という新しい進化モデルが提案された。

本研究は原腸胚オーガナイザーの進化における、遺伝子制御ネットワークの保存性と多様化の両面を初めて実証的に示したものである。刺胞動物胚での遺伝子過剰発現による二次軸誘導や、脊椎動物初期胚を用いた転写因子に対するChIP-seq、脊椎動物胚を用いた脊椎動物以外の動物のCRM 解析といった斬新な試みから、進化発生学分野に多くの新しい知見を示した点で高く評価できる。

なお、印刷公表した論文中のLim3 の解析の一部は共著者の小林正明博士、西駕秀俊博士によるものであり、現在投稿中の論文中のバイオインフォマティクス解析の一部は共著者の鈴木穣博士、菅野純夫博士らによるものであるが、本論文に記載されている解析は全て論文提出者が主体となって分析および検証を行ったものであり、論文提出者の寄与が十分であると判断する。

したがって、博士(理学)の学位を授与できると認める。