Polyion complexes formed from polycations and negatively charged nucleic acids, such as plasmid DNA (pDNA) and messenger RNA (mRNA), have been recognized as promising carriers for gene-related molecular therapy. The design of the complexes, termed as polyplexes, is still a critical issue to achieve efficient and safe introduction of nucleic acid compounds into target cells. Efficient endosomal escape plays a key role to obtain efficient transgene expressions. There is a previous report that a polyaspartamide derivative with two repeating aminoethylene units in the side chain, poly{N-[N'-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl]aspartamide} (PAsp(DET)), showed high transfection efficiency with low cytotoxicity. The detailed investigations revealed that the capacity of pH-sensitive membrane destabilization contributed to the efficient endosomal escape of polyplexes formed from PAsp(DET). These studies motivated the author to further investigate the relationship between the protonation behavior and biological properties of the N-substituted polyaspartamides possessing the different number of repeating aminoethylene units in the side chain.

A series of the N-substituted polyaspartamides possessing the different number of the repeating aminoethylene units in the side chain were synthesized by the aminolysis reaction of poly(β-benzyl-L-aspartate) (PBLA) with ethylenediamine (EDA), diethylenetriamine (DET), triethylenetetramine (TET), and tetraethylenepentamine (TEP) to obtain poly[N-(2-aminoethyl)aspartamide] (PAsp(EDA)), PAsp(DET), poly(N-{N'-[N''-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl]-2-aminoethyl}aspartamide) (PAsp(TET)), and poly[N-(N'-{N''-[N'''-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl]-2-aminoethyl}-2-aminoethyl)aspartamide] (PAsp(TEP)), respectively. The quantitative aminolysis of the side chain was confirmed by NMR. The obtained polymers were characterized by the potentiometric titration to estimate their protonated states. The pronation degree and pKa of the N-substituted polyaspartamides were calculated for each polymer. The detailed protonated structures were estimated by a computer simulation (the SPARC on-line calculator http://ibmlc2.chem.uga.edu/sparc/) of low molecular model compounds. The protonation degrees calculated by the computer simulation of model compounds were correlated with those by the potentiometric titration of polyaspartamides, suggesting that the calculated protonated structures of model compounds were reasonable to explain the protonated states of the repeating aminoethylene units in the side chain of N-substituted polyaspartamides.

Those polyaspartamides were applied to the pDNA delivery against a human hepatoma (Huh-7) cells. As a result, a distinctive odd-even effect of repeating number of aminoethylene units was observed on the endosomal escape and the transfection efficiency of the polyplexes constructed from these polyaspartamides, as the polyaspartamides possessing the even number of repeating aminoethylene units (PA-E) allowed more efficient endosomal escape and transfection efficiency of the polyplexes than those possessing the odd number of repeating aminoethylene units (PA-O). This odd-even effect was correlated with the membrane destabilization activity of the polyaspartamides. Indeed, PA-Es showed the stronger cellular membrane destabilization activity selectively at acidic endosomal pH than PA-Os. Eventually, it was concluded that the strong membrane destabilization is assumed to be induced by the formation of di-protonated structure in 1,2-diaminoethane units (-NH2+-CH2-CH2-NH2+-) in PA-E side chains at acidic pH.

Next, the N-substituted polyaspartamides were applied to mRNA delivery to Huh-7 cells. The efficiencies for protein expressions from mRNA polyplexes varied depending on the incubation time of the polyplexes in the culture medium. At the early time-point within several hours, PA-E polyplexes showed higher transfection efficiencies than PA-O polyplexes, which corresponding to the order of the expressions from pDNA polyplexes. In contrast, after one or more days of transfection, polyplexes formed from PAsp(TET) showed the highest transfection efficiency, followed by those from PAsp(TEP), PAsp(EDA), and PAsp(DET). The endosomal escaping efficiencies of mRNA polyplexes showed similar tendencies to those of the pDNA polyplexes; PA-E polyplexes appeared to disperse more efficiently in entire cytoplasmic region than the PA-O polyplexes from the observation by the confocal laser scanning microscopy. These results suggest that, in the case of mRNA, the endosomal escaping ability of mRNA polyplexes played a critical role to achieve protein expressions at an early time point. At the longer time point, the resistance of mRNA polyplex against RNase is likely to be correlated with the tendency of the protein expression of mRNA polyplexes. Indeed, PA-O polyplexes showed the higher resistance against RNase than PA-E polyplexes. In the cytoplasm, the higher resistance of PA-O polyplexes to RNase contributes to their longer survival compared to PA-E polyplexes at the longer incubation, leading to the highest protein expressions of PAsp(TET) polyplexes.

In conclusion, the present study demonstrated that subtle difference in the number of repeating aminoethylene units in the N-substituted polyaspartamide side chain induced the large difference in the biological performance of polyplexes. In pDNA delivery, polyplexes from PA-Es (PAsp(DET) and PAsp(TEP)) possessing the strong membrane destabilization ability in the endosome showed the higher transfection efficiency than those from PA-Os (PAsp(EDA) and PAsp(TET)). On the other hand, in the mRNA delivery, the polyplex stability is a critical factor for the persistent expression because of the instability of mRNA relative to pDNA. In fact, PAsp(TET) polyplexes possessing the lower endosome escape ability and higher stability against RNase than PAsp(DET) and PAsp(TEP) polyplexes showed the highest transfection efficiency at longer incubation time. These findings are useful for the development of the new carrier systems for the safe and efficient nucleic acids delivery.

遺伝子治療は既存の治療法では治療困難な疾患、特にがん、心疾患、先天性遺伝子疾患の治療を目指して1700以上の臨床試験が試みられてきた。これらの臨床試験の大部分はウイルスキャリアで行われているが、ウイルスの不活性化の失敗など事故が報告されたため、ウイルスキャリアの安全性が疑問視されている。そのため、非ウイルスキャリアが注目を集めている。カチオン性高分子と核酸の複合体(ポリプレックス)はそのような非ウイルスキャリアの一つであり、ウイルスキャリアと比較して安全で製造も容易という利点がある。しかし、遺伝子導入効率が未だ低いという問題点も指摘されている。さらに高い導入効率を可能とするカチオン性高分子の開発を目指した研究が進められているが、カチオン性高分子の構造とその導入機構の相関は十分明らかになったとはいえない。申請者はこのような研究背景に基づいてカチオン性高分子の構造と導入機構の相関を明らかにし、さらに高効率なカチオン性高分子の設計の指針を得ることを目指した研究を行った。まず、同一主鎖を有し、側鎖のアミノエチレン構造の繰り返し数のみが異なるポリマーを合成し、それぞれの化学的特性とpDNA及びmRNAとの複合体の細胞への導入機構を生物学的及び化学的手法を用いて解析し、化学構造と導入機構の相関について考察した内容を本学位請求論文としてまとめている。

第一章は序論として、遺伝子治療の現状と今回の研究で内包核酸として使用したpDNA及びmRNAのそれぞれの特性とアミノエチレン構造の繰り返し構造の遺伝子導入機構における特性について紹介することで、本研究の意義と論点を述べている。

第二章は、アミノエチレン構造の繰り返し構造のみ異なる4種のポリカチオンの合成と、その化学的特性の解析についてまとめている。ポリベンジル-L-アスパルタミドの側鎖にアミノリシス反応でエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミンを導入することで、4種のポリカチオンを合成する経路が述べられている。この合成法により、同一主鎖同一重合度を有し、側鎖のアミノエチレン構造の繰り返し数のみが異なる4種のポリカチオンが得られている。さらに、これらのポリカチオンのpH応答性を調べるために、滴定と側鎖のモデル化合物のシミュレーションを行っている。滴定とシミュレーションの結果は良い相関を示し、pH 1 ~ 14での側鎖のプロトン化状態の評価が合理的に示されている。これらの結果より、以後のpDNAとmRNAの導入機構を側鎖のプロトン化状態から考察することが可能となった。

第三章は、4種のポリカチオンによるpDNA導入についてまとめている。pDNA導入において、4種のポリカチオンは側鎖のアミノエチレン構造の繰り返し数において偶奇性を示すことが見出されている。すなわち、偶数のアミノエチレン構造を有するポリカチオンは明らかに奇数のものよりも高い遺伝子導入効率を示した。この導入効率の偶奇性は、側鎖の偶数のアミノエチレン構造が、エンドソーム環境応答的に細胞膜傷害活性を上昇させ、エンドソーム膜を不安定化することで、ポリプレックスのエンドソームからの脱出を促進させるためであると考察している。また、この環境応答的な細胞膜傷害活性の上昇は、これらの側鎖が細胞外環境(pH 7.4)からエンドソーム内環境(pH 5.5)に下がるとプロトンを受容し、高荷電密度な構造であるジプロトン化ジアミノエタン構造を形成するためであることを上述のシミュレーションの結果から考察している。この特異的なプロトン化構造のエンドソーム脱出への寄与は今まで報告がなく、pDNA導入に適したポリカチオンの設計において重要な知見が得られたと結論づけている。

第四章は、4種のポリカチオンによるmRNA導入についてまとめている。3回のアミノエチレン繰り返し構造を有するポリカチオンとmRNAから作成したポリプレックスを導入した細胞は他のポリプレックスを導入した細胞よりも高い発現を示すことが見出されている。これは繰り返し数3回のポリカチオンが細胞質内で内包mRNAの分解を抑制し、発現の持続性を高めているためであることが、共焦点顕微鏡観察から示唆されている。これより、同ポリカチオンはmRNAと緊密なポリプレックスを形成することで、内包mRNA分解を効率的に抑制していると考察している。また、ポリプレックスの緊密度はポリカチオンの側鎖の電荷密度及び立体障害と相関することも確認されている。なお、この構造依存的なRNaseによる分解の抑制と、mRNA発現持続性との因果関係の証明はこれまで報告されていない全く新しい知見である。mRNAの発現持続性が短いことはmRNA導入の実用化に向けた問題点の一つである。今回の研究では、最適設計されたポリカチオンにより、mRNAからのタンパク発現の持続性を延長させることに成功しており、この問題点を解決する方法論を提供するものと評価される。

第五章は総括であり、効率の良いpDNA及びmRNA導入を実現するために、ポリカチオン構造に要求される機能と化学的構造・特性についてまとめている。

以上のように、本論文ではカチオン性高分子を用いたpDNA及びmRNA導入において、高い導入効率を得るための高分子構造と細胞内メカニズムとの相関関係が、一連の実験から実証されており、遺伝子・核酸医薬治療に最適なバイオマテリアルとしてのポリカチオンの分子設計に向けた有益な知見が得られている。

よって本論文は博士(工学)の学位請求論文として合格と認められる。