Strigolactones (SLs) are plant hormones that regulate plant growth and development including shoot branching. They also trigger germination of seeds of parasitic plants of the genus Striga and stimulate plant symbiosis with arbuscular mycorrhizal fungi. In rice, it has been reported that at least 3 Dwarf (D) genes, D10, D17/HTD and D27, are involved in SL biosynthesis, and the D3 gene is involved in SL signaling. The D14/D88/HTD2 gene has also been thought to function in SL signaling or metabolism. The aim of this study was to understand the molecular mechanisms that regulate rice mesocotyl elongation during germination and growth in darkness, especially the antagonistic interaction between phytohormones SLs and cytokinins (CKs).

1.SLs negatively regulate mesocotyl elongation in rice during germination under darkness

Mesocotyl is a tissue located between the coleoptilar node and a basal part of the seminal root in young seedlings. Mesocotyl elongation of young seedlings grown under darkness or submerged conditions contributes to survival in paddy fields. However, a long mesocotyl emerged from the soil surface may cause lodging of seedlings, so that mesocotyl elongation should be tightly regulated in response to environmental cues. After seeds were germinated and grown under darkness for 8 days, it was found that mesocotyl elongation was greater in rice mutants defective in SL-biosynthesis or signaling genes than in the wild-type. Exogenous application of a synthetic SL analog, GR24, rescued the normal mesocotyl phenotype in the SL-deficient mutants, d10-1, d17-1 and d27-1, in a dosage-dependent manner, but did not affect mesocotyl lengths of the SL-insensitive mutants, d3-1 and d14-1. It has been known that growth of mesocotyl is controlled not only by the lengthwise elongation of each cell, but also by an increase in the number of cells by cell division. No significant differences in the cell lengths of the mesocotyls were found between the d mutants and the wild-type, except for the short cell length observed at the lower half of the d3-1 mesocotyl. On the other hand, the number of cells in the mesocotyls was 3-6 fold greater in the d mutants than in the wild-type. Treatment with GR24 reduced the number of cells in the d10-1 mesocotyl to the wild-type level, but did not affect the number of cells in the d3-1 and d14-1 mesocotyls. These findings indicate that SL negatively regulates cell division, but not cell elongation, in rice mesocotyl during germination and growth under darkness.

2.Antagonistic interaction between SL and CK in regulating mesocotyl elongation

CKs are the only class of plant hormones known to promote cell division. To determine whether the longer-mesocotyl phenotype of the d mutants was associated with increased CK levels in the mesocotyl, endogenous concentrations of several common natural isoprenoid CKs, namely N6-(Δ2-isopentenyl)-adenine (iP) and trans-zeatin (tZ), and their riboside derivatives, were measured. The tZ contents of the mesocotyls of both d10-1 and d14-1 were significantly higher than that in the wild type. Interestingly, upon treatment with GR24, the content of tZ-type CKs in the d10-1 mesocotyl decreased dramatically to the wild-type level. However, the tZ-type CK contents in both the wild type and d14-1 were not affected by GR24. Identification, by microarray analysis, of several SL-regulated genes helped us to understand the possible mechanism of SL and CK interaction in regulating mesocotyl elongation. Rice cytokinin oxidase 9 (OsCKX9), which encodes a CK degradation enzyme, was found to be up-regulated by SL, suggesting that reduced expression of OsCKX9 in the d mutants caused tZ-type CK accumulation in the mesocotyls and enhanced cell division. To confirm the interaction between SL and CK in the mesocotyl elongation, kinetin or cytokinin oxidase inhibitor, 1-(2-chloro-4-pyridryl)-3-phenylurea (CPPU), was applied to the seedlings. Treatment with kinetin or CPPU did not affect the mesocotyl elongation of the d mutants, but it enhanced the lengths of mesocotyls of the wild type in a dose-dependent manner. Treatment with kinetin or CPPU, together with GR24, confirmed the antagonistic function of these two hormones on mesocotyl elongation. Together, these results suggest that reduced expression of OsCKX9 in the d mutants causes tZ-type CK accumulation in mesocotyl and enhances cell division, suggesting that SL and CK antagonistically regulate cell division of mesocotyl and its elongation during germination and growth under darkness.

In the microarray analysis, a TCP family transcription factor, OsTCP2, was identified as an SL up-regulated gene. Recently, several TCP family transcription factors, including ZmTB1 (maize), AtBRC1 and AtBRC2 (Arabidopsis), SbTB1 (sorghum), PsBRC1 (pea) and OsTB1/OsFC1 (rice), were selected as downstream regulators of the SL pathway that controls bud activity. Both OsTCP2 and all of the TB1/BRC genes belong to the class II TCP sub-family, whose members are known to repress organ growth by inhibiting cell proliferation. Expression of OsTCP2 was decreased in the d-mutant mesocotyls compared to those in the wild-type mesocotyl. Application of kinetin or CPPU reduced the expression of OsTCP2 in wild-type mesocotyl, but not in the d-mutant mesocotyls. Moreover, overexpression of OsTCP2 clearly impaired the CK-induced mesocotyl elongation. Together, these results suggest that OsTCP2 negatively controls mesocotyl elongation and is antagonistically regulated by SL and CK in the mesocotyl.

Finally I proposed a model for the interactions between SL and CK in regulating rice mesocotyl elongation. In wild-type rice, endogenous SLs induce the expression of CKX, thus reducing CK levels. Thus, the inhibition of the expression of some TCP family genes, such as OsTCP2 and OsTB1, is impaired. OsTCP2 and OsTB1 negatively regulate cell division, resulting in a shorter mesocotyl and less branching, respectively. In d mutants, a deficiency of SL or insensitivity to SL results in an increase in CK levels in the mesocotyl, which thus inhibits the expression of OsTCP2; cell division is therefore enhanced in the mesocotyls of the d mutants.

本研究は、腋芽伸長の抑制に関わるストリゴラクトン(Strigolactones)が、イネの発芽時におけるメソコチル伸長の抑制にも関与することを明らかにし、メソコチル伸長の分子機構の一端を解明したものであり、次の2つの章から構成されている。

1.ストリゴラクトンによるイネのメソコチル伸長の抑制

ストリゴラクトンは、植物の腋芽伸長を抑制する植物ホルモンとして同定された一群のラクトン構造を有するカロテノイド誘導体である。イネでは、多分げつ矮性を示すdwarf (d) 変異体の系統において、その原因遺伝子がストリゴラクトンの生合成やシグナル伝達に関与することが知られている。

メソコチル(中胚軸)は、イネ科植物の幼植物体の鞘葉(子葉鞘)節と種子根の基部の間に位置する組織であり、暗所でその伸長が促進される。イネのストリゴラクトンの生合成が低下した変異体(d10-1、d17-1、d27-1)および感受性が低下した変異体(d3-1、d14-1)の種子を暗所で8日間発芽伸長させたところ、これらの変異体のメソコチルは野生型のものよりも2-5倍長くなることが明らかになった。さらに、暗所で8日間、合成ストリゴラクトンであるGR24を含む培地上でd変異体と野生型の種子を発芽伸長させたところ、ストリゴラクトン生合成変異体であるd10-1、d17-1、d27-1におけるメソコチルの伸長がGR24の濃度依存的に抑制されることが分かった。その一方で、ストリゴラクトン非感受性変異体であるd3-1、d14-1では、GR24処理によってメソコチル伸長は変化しなかった。

イネのメソコチルは、細胞分裂による細胞数の増加に加え、長軸方向の細胞伸長によって伸長する。そこで、暗所で8日間発芽伸長させたメソコチルにおける長軸方向の細胞の長さと細胞数を調査した結果、d変異体におけるメソコチルの長軸方向の細胞数は野生型の細胞数の3-6倍であることが明らかになった。しかし、細胞の長さについてはd変異体と野生型の間で有意差がなかった。d3-1、d14-1では、GR24処理による細胞数の変化はみられなかったが、d10-1の細胞数は、GR24処理によって野生型と同程度まで減少することが示された。これらの結果から、ストリゴラクトンが細胞分裂を負に制御することで、メソコチルの伸長を抑制する機能をもつことが明らかになった。

2.ストリゴラクトンとサイトカイニンの拮抗作用によるイネのメソコチル伸長制御

サイトカイニン(Cytokinins)は細胞分裂を促進する活性をもつ植物ホルモンとして知られていることから、d変異体におけるメソコチル伸長の促進が内生のサイトカイニン量の変化に起因するかどうかを調査した。暗所での発芽4日目のd変異体と野生型のメソコチルにおいて、活性型サイトカイニンとして知られているtrans-zeatin(tZ)、N6- (Δ2-isopentenyl) -adenine(iP)とそれらの不活性型リボシド体(tZR、iPR)の蓄積量をLC-MS/MS法によって測定した。その結果、野生型と比較して、d変異体のメソコチルではtZの蓄積量が有意に高いこと、さらに、ストリゴラクトン生合成変異体d10-1におけるtZの蓄積量がGR24処理によって有意に減少することが明らかになった。しかし、iP 、tZR、iPRの蓄積量についてはd変異体と野生型の間で大きな差はみられなかった。これらのことから、ストリゴラクトンによってメソコチル内のtZ量が制御されていることが示唆された。その制御に寄与する遺伝子を明らかにするために、マイクロアレイ解析を行い、野生型と比べてd変異体で遺伝子の発現量が変動し、さらに、d10-1へのGR24処理によってその発現量が有意に変動する遺伝子の探索を行った。その結果、サイトカイニンの分解を担うcytokinin oxidase/dehydrogenase 9(OsCKX9)をコードする遺伝子の発現が、d変異体のメソコチルでは野生型と比較して低く、d10-1へのGR24処理によって野生型レベルまで戻ることが分かった。この結果より、野生型ではストリゴラクトンによって誘導されたOsCKX9が、tZの蓄積を抑えることでメソコチルの伸長を抑制することが示唆された。さらに、暗所で8日間、サイトカイニン活性を持つカイネチン(kinetin)またはCKXの阻害剤である1- (2-chloro-4-pyridyl) -3-phenylurea(CPPU)で処理したところ、d変異体では処理によってメソコチル伸長は変化しなかったが、野生型では濃度依存的なメソコチル伸長の促進が観察された。カイネチンまたはCPPUとGR24を同時に処理した場合、GR24処理によって抑制されたd10-1のメソコチルの伸長が、カイネチンまたはCPPUによって促進されることから、ストリゴラクトンとサイトカイニンはメソコチルの伸長過程において細胞分裂を拮抗的に制御することが示された。

d変異体を用いたマイクロアレイ解析の結果から、TCPファミリーのクラス IIに属する転写因子であるOsTCP2をコードする遺伝子の発現が、d変異体のメソコチルでは野生型と比較して低く、d10-1においてGR24処理により野生型レベルまで戻ることが明らかになった。また、OsTCP2遺伝子の発現は、カイネチンまたはCPPUで処理した野生型のメソコチルでは抑制されるが、d変異体では影響されなかった。さらに、OsTCP2遺伝子の過剰発現体では、カイネチンまたはCPPU処理によるメソコチル伸長の促進が起こらないことから、OsTCP2が、メソコチル伸長過程の細胞分裂を抑制する機能をもち、その機能はOsTCP2遺伝子の発現制御を介して、サイトカイニンによって抑制され、ストリゴラクトンによって促進されることが示唆された。

これらの結果より、野生型においては、ストリゴラクトンがOsCKX9を発現誘導することで内生サイトカイニンの蓄積量を抑え、それにより細胞分裂の抑制に関わる転写因子OsTCP2の発現抑制が解除され、メソコチルの伸長が抑制されるというモデルを提唱した。d変異体ではストリゴラクトンの生合成および感受性の低下により上述の経路が機能せず、細胞分裂が活性化されることで、メソコチル伸長が促進されると考えられた。

以上、本研究では、暗所でのイネの発芽伸長過程で、ストリゴラクトンとサイトカイニンの拮抗的な細胞分裂の調節によってメソコチルの伸長が制御されていることを世界に先駆けて発見し、学術上の価値が高い。したがって、審査委員一同は、本論文が博士 (農学) の学位論文として価値あるものと認めた。