The cdks play a crucial role in progression of the cell cycle through G1-S phase. Fibroblast cells upon anchorage deprivation get arrested at G1 phase of the cell cycle leading to inactivation of cdks and destabilization of Cdc6 protein. According to findings in our laboratory, anchorage deprivation from rat embryonic fibroblasts (REF) leads to inactivation of the mTORC1 pathway, whereas in REF cells with constitutive activation of mTORC1 all the effects of anchorage deprivation are overcome. It was also observed that inhibition of the mTORC1 pathway by rapamycin reduces the activity of Cdk4 kinase. Therefore to find the link between mTORC1 pathway and the regulation of activating phosphorylation of Cdk4, two-dimensional electrophoresis was used as a tool. By constructing and comparing Thr172Ala and Thr177Ala non-phosphorylatable mutants with wild type Cdk4 and Cdk6 respectively, I supposed that Thr172- Cdk4 and Thr177- Cdk6 are represented by the most negatively charged spot no.4 in isoelectric focusing dot patterns. In Tsc2-/- REF with overexpression of Cdc6 and Rheb proteins, I found that inactivation of both mTORC1 and ERK pathways are required for suppression of activating phosphorylation of Cdk4/6. I also found that S6 kinase inhibition and ERK inhibition also leads to a complete disappearance of Thr172/177 Cdk4/6 phosphorylation. I further found that inhibition of both mTORC1 and ERK inhibits the assembly of Cdk7 with Cyclin H. All these data suggest that either one of the mTORC1 or ERK pathways are required for the formation of CAK (Cyclin Activating Kinase). Consistently, Mat1 the assembly factor for CAK contains a consensus S6kinase phosphorylation-target like sequence conserved among different organisms for example human, mouse, rat, xenopus, and drosophila.

Cyclin-dependent kinase activating kinase (CAK) は、サイクリン依存性キナーゼのTループ領域をリン酸化する酵素で、ほとんどすべてのサイクリン依存性キナーゼの活性化に必須であるとともに、転写開始因子TFIIHの必須サブユニットでもある。CAKはCdk7とサイクリンHとアッセンブリー因子であるMAT1からなる複合体である。これまで多くの研究にも拘らず、その活性を制御する機構はその存在すら疑われるほど未知であった。

本研究は、細胞周期開始時に働くサイクリンD依存性キナーゼであるCdk4およびCdk6のTループ領域のリン酸化を指標に、CAKの活性制御の可能性を探り以下の結果を得た。

1.Cdk4およびCdk6のTループ領域の非リン酸化型変異タンパクを細胞に発現させ、正常型とともに等電点ゲル電気泳動とSDSゲル電気泳動を組み合わせた二次元電気泳動を行いTループ領域のリン酸化型の泳動位置をまず同定した。

2.mTORC1の特異的阻害剤であるラパマイシンとMEKの特異的阻害剤であるPD184352で細胞を同時に処理すると、足場消失によるG1期停止の有無にかかわらず、Tループ領域のリン酸化が消失ないし減弱した。それぞれ単独の処理では効果はなかった。

3.両阻害剤による同時処理を行うと、細胞内のCdk7、サイクリンH、MAT1の量には変化なかったが、Cdk7と結合しているサイクリンHの量が著しく減少した。

4.mTORC1の下流因子であるS6キナーゼの阻害剤H89とPD184352との同時処理でもTループ領域のリン酸化が消失ないし減弱した。

5.S6キナーゼのリン酸化標的配列様の配列がMAT1に存在しショウジョウバエMAT1まで進化的に保存されていることを見出した。

6.この部位をリン酸化類似型であるグルタミン酸に変えた変異MAT1を発現させ、両阻害剤に対する感受性を調べたところ、Cdk4のTループリン酸化、CAKのアッセンブリーへの影響を見る限り、感受性を消失していた。

7.正常型を発現させた場合、両阻害剤によって著しい細胞死誘導が起こるのに対し、上記の変異MAT1を発現させた細胞では、細胞死が著しく抑制されていた

以上の結果ら、MAT1が少なくともS6キナーゼによりリン酸化を受け、活性化される機構の存在が浮かび上がった。本研究は、これまでその存在すら疑われてきたCAKの活性制御機構の存在の可能性を明らかにしたもので、細胞外シグナルにより細胞の増殖制御の全貌の解明に貢献するもので、学位の授与に値すると考えられる。