During the G1-S transition, p27(KIP1) a potent inhibitor of Cyclin Dependent Kinases inhibit the kinase activity of Cdk2. This p27(KIP1) in rodent fibroblasts undergoes post-translational modification by phosphorylation, at serine-10, threonine-187 and C-terminal threonine-197 sites by KIS, Cdk2, and Pim or ROCK kinases, respectively. Recently Cdc6 the AAA+ ATPase, identified initially to assemble pre-replicative complexes on origins of replication and later to activate p21CIP1-inactivated Cdk2, was also found to activate p27-bound Cdk2, but only after the bound p27 is C-terminally phosphorylated at threonine-197. On the other hand, the biological significance of the serine-10 phosphorylation remains elusive, beside its involvement in p27's stability.

I report here that serine-10 phosphorylation is pre-requisite for efficient C-terminal phosphorylation of itself by Pim or ROCK kinases, and also critically controls the potency of p27 as a Cdk2 inhibitor. In, In-vitro, Pim1 and active ROCK1 can efficiently phosphorylate free as well as Cdk2-bound p27, but only after the p27 was phosphorylated at serine-10 in advance. Consistently, an S10-nonphosphorylatable mutant of p27 protein could not be phosphorylated at the C-terminus in vivo. Furthermore, when unbound form of p27 was doubly phosphorylated, it could no longer act as a potent inhibitor of Cdk2, whereas Cdk2-bound p27 could be removed by Cdc6 to reactivate the Cdk2 only after it get phosphorylated at both sites. Thus, phosphorylation at these two sites crucially controls the potency of this CDK inhibitor in two distinct modes.

p27(KIP1)は、細胞周期のG1期からS期への進行の過程で、主にCdk2の活性を負に制御するCDK不活化因子である。これまで幾多の研究にも拘らず、この過程で染色体の複製開始に必須なCdk2の活性化がどのように制御されているかは、不明であった。最近、当所属研究室で、G1期でp27(KIP1)によって不活化されたCdk2がCdk2に結合したp27(KIP1)のC-末端がリン酸化を受けると、染色体上の複製開始点に複製前複合体を充填させるAAA+ ATPaseであるCdc6が、不活化されたCdk2に結合しATPの加水分解エネルギーを利用して結合しているp27(KIP1)を外し、Cdk2を活性化することが見出された。一方、細胞がG1期からS期へ進行する際、p27(KIP1)は、主にKISキナーゼによってセリン10残基のリン酸化を、PIMおよびROCKキナーゼによってC-末端のスレオニン残基のリン酸化を受けることが知られている。

本研究は、p27(KIP1)のリン酸化によるp27(KIP1)のCdk2の不活化能への影響を生化 学的、分子生物学的に検討し以下の結果を得た。

1.大腸菌で発現させた組換えp27(KIP1)およびPIM1あるいは活性型ROCK1と繊維芽細胞で発現させ精製したKISを用いたIn Vitro実験で、KISによるセリン10残基のリン酸化を行わない限り、PIM1あるいはROCK1によるp27(KIP1)のC末端のリン酸化が起きないことを見出した。

2.Cdk2に結合したp27(KIP1)について同様の実験を行ったが、結果は同じであった。

3.In Vitro実験結果の確認として、セリン10残基をリン酸化を受けないアラニン残基に変えた変異p27(KIP1)を繊維芽細胞で発現させC末端のリン酸化の有無を調べたところ、正常なp27(KIP1)と異なりC末端のリン酸化が全く見られず、In Vitroの実験結果と一致していた。

4.次にリン酸化によるp27(KIP1)のCdk2不活化能への影響を組換えCdk2/サイクリンA複合体を用いてIn Vitro実験で調べたところ、未リン酸化型やセリン10リン酸化型のp27(KIP1)と異なり、セリン10とC末端にリン酸化されたp27(KIP1)は、Cdk2の不活化能を消失していることが判明した。

5.一方、Cdk2に結合したp27(KIP1)については、両残基がリン酸化された場合でもCdk2は不活化されたままであったが、この場合、Cdc6によってATP依存性に結合したp27(KIP1)が取り除かれ、Cdk2の活性化が起こった。

以上の結果ら、p27(KIP1)によるCdk2の活性制御に関して、リン酸化を介した新しい制御機構の存在を明らかにした。本研究は、これまで知られていなかった機構によりCdk2の活性が制御されていることを発見したもので、発がん機構の解明に大きく貢献するものと期待され、学位の授与に値すると考えられる。