The trans-synaptic interaction of postsynaptic glutamate receptor δ2 and presynaptic neurexins (NRXNs) through cerebellin precursor protein 1 (Cbln1) mediates synapse formation in the cerebellum (Uemura, T., Lee, S. J., Yasumura, M., Takeuchi, T., Yoshida, T., Ra, M., Taguchi, R., Sakimura, K., and Mishina, M. (2010) Cell 141, 1068-1079). This finding raises a question whether other members of the Cbln family interact with NRXNs to regulate synapse formation in the forebrain. Here, I showed that Cbln1 and Cbln2 induced presynaptic differentiation of cultured cortical neurons, while Cbln4 exhibited little activity. When compared with neuroligin 1, Cbln1 and Cbln2 induced preferentially inhibitory presynaptic differentiation rather than excitatory one in cortical cultures. The synaptogenic activities of Cbln1 and Cbln2 were suppressed by the addition of the extracellular domain of NRXN1β to the cortical neuron cultures. Consistently, Cbln1 and Cbln2 showed robust binding activities to NRXN1α and three β-NRXNs, while only weak interactions were observed between Cbln4 and NRXNs. The interactions of Cbln1, Cbln2 and Cbln4 were selective for NRXN variants containing splice segment 4. Affinities for NRXNs estimated by surface plasmon resonance analysis were variable among Cbln subtypes. Cbln1 showed higher affinities to NRXNs than Cbln2. The binding ability of Cbln4 was much lower than those of Cbln1 and Cbln2. The affinities of Cbln1 and Cbln2 were comparable between NRXN1α and NRXN1β, but those for NRXN2βand NRXN3βwere lower. These results suggest that Cbln1 and Cbln2 play a role in synapse formation of cortical neurons by interacting with NRXNs containing S4.

本研究は大脳のシナプス形成に重要な役割を演じていると考えられる細胞接着分子であるneurexin(NRXN)と分泌蛋白であるcerebellin precursor protein(Cbln) の相関関係を明らかにするため蛋白質の結合を生化学的に解析を試みたものであり下記の結果を得ている。

1. NRXN variant - NRXN1α, NRXN1β, NRXN2β, NRXN3βとsplice segment 4がdeletion されたNRXN1α(-S4), NRXN1β(-S4), NRXN2β(-S4), NRXN3β(-S4)を作成した。そしてCbln1, Cbln2, Cbln4, NRXN1α-ECD, NRXN1β-ECD, NRXN2β-ECD, NRXN3β-ECD, NRXN1α(-S4)-ECD, NRXN1β(-S4)-ECD, NRXN2β(-S4)-ECD, NRXN3β(-S4)-ECD蛋白をfree style 293 細胞に発現させ精製した。

2.Magnetic beadsにそれぞれ精製したCbln1, Cbln2, Cbln4の蛋白を結合させた後このbeadsを培養された大脳皮質ニュ-ロンに入れて培養させた。その後bassoon, VGLUT1, VGATの抗体を用いて免疫染色を行ったところ、Cbln1、Cbln2を結合させたbeadsではbassoon signalが集まる事を観察した。VGLUT1はCbln1を結合させたbeadsのみ弱くsignalが集まる事を見られたがVGATはCbln1, Cbln2を結合させたbeadsで強くsignalが集まる事を見られた。しかし、Cbln4を結合させたbeadsではsignalが集まる事を観察できなかった。

3. Cbln1, Cbln2, Cbln4よるbassoon, VGLUT1, VGATのsignalの集まりがNRXN1β-ECD蛋白によってsuppressionされる事を確認するためmagnetic beadsにそれぞれ精製したCbln1, Cbln2, Cbln4の蛋白を結合させたbeadsと精製したNRXN1β-ECD蛋白を培養された大脳皮質ニュ-ロンに入れて培養させた。その後bassoon, VGLUT1, VGATの抗体を用いて免疫染色を行ったところ、NRXN1β-ECD蛋白を入れたgroupでCbln subtypeによるbassoon, VGLUT1, VGATのsignalの集まりがsuppressionされた事を観察した。

4. Cell surface binding assay を用いてNRXN variantとCbln subtypeがdirectly interactionする事を確認した。培養されたHEK293T cellにNRXN1α, NRXN1β, NRXN2β, NRXN3βとsplice segment 4がdeletion されたNRXN1α(-S4), NRXN1β(-S4), NRXN2β(-S4), NRXN3β(-S4)のDNA をtransfectionさせた後それぞれ精製したCbln1, Cbln2, Cbln4蛋白を入れた。その後免疫染色を行ったところ、splice segment 4を含むNRXN variantsはCbln1, Cbln2, Cbln4蛋白と結合する事を見られたがsplice segment 4がdeletion されたNRXN variantsは結合できなかった。Cbln1, Cbln2はNRXN variantsと強く結合しましたがCbln4は非常に弱く結合する事を見られた。

5. Pull-down assayを用いてNRXN variantsとCbln subtype蛋白がdirectly interactionする事を確認した。Protein A beadsに精製したHA-Cbln1, HA-Cbln2, HA-Cbln4, NRXN1α-ECD-Fc, NRXN1β-ECD-Fc, NRXN2β-ECD-Fc, NRXN3β-ECD-Fc, NRXN1α(-S4)-ECD-Fc, NRXN1β(-S4)-ECD-Fc, NRXN2β(-S4)-ECD-Fc, NRXN3β(-S4)-EC-Fc蛋白を入れて反応させた後HAとFc抗体を用いてwestern blotを行ったところ、splice segment 4を含むNRXN variantsのみでCbln subtypeと結合する事を見られた。一方Cbln4とsplice segment 4を含むNRXN variantsとの結合力は非常に弱かった。

6. 分子間相互解析装置(Biacore)をもちいて相互作用の速度論的解析(Surface Plasmon Resonance assay)を行ったところ、NRXN variants とCbln subtypeとの結合親和力(KD value)は次の通りだった。Cbln1はNRXN1β, NRXN1α, NRXN2β, NRXN3βの順番で、Cbln2 はNRXN1β, NRXN1α, NRXN3β and NRXN2β順番で結合親和力ある事を明らかにした.

以上、本論文は細胞接着分子であるNRXNのvariantsと分泌蛋白Cbln subtypeとの結合は大脳皮質ニュ-ロンのシナプス形成を誘導する事を明らかにした。特にNRXN variantsとCbln1, Cbln2は強い結合力を確認したがCbln4は非常に弱い結合力を持っている事を明らかにした。本研究はNRXN variantsとCbln subtypeの結合は大脳ニュ-ロンのシナプス形成の解明に重要な貢献をなすと考えられ、学位の授与に値するものと考えられる。