Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be generated from differentiated somatic cells by viral-mediated transduction of defined transcription factors, c-MYC, OCT4, SOX2, and KLF4. A number of modified reprogramming devices have been developed. However, all of the methods using viral vectors or plasmid DNAs already contain some probable risks from remained transgenic viral vector sequences, undegraded pDNAs, and potential transgenic insertions. Transduction of exogenously expressed recombinant transcription factors fused with cell-penetrating peptide (CPP) can generate mouse and human iPSCs. In recent years, a number of groups have reported the generation of mouse iPSCs using recombinant proteins purified from E.coli and human iPSCs using crude cell extracts. These protein transduction methods do not have a potential risk of insertional mutagenesis due to viral vectors, pDNAs or doxycycline-inducible systems, etc. However, there are some demerits or limitations to the practical application, because purification of recombinant proteins and establishment of iPSCs colonies with these transduction methods are laborious and time-consuming task compared to those with viral vector-mediated gene transfer.

We therefore explored a practical application of the generation of protein-induced iPSCs using genetically modified SNL feeder cells secreting recombinant proteins (SP-SNLs). For the generation of these transformed SNLs, we constructed mammalian expression vectors pSecTag2 expressing and secreting reprogramming factors. To efficiently transduce these secreted reprogramming factors into target cells, we conceived the idea of adding TAT, protein transduction domain (PTD) or other PTDs will be needed in the expression vectors. However, we also considered the possibility that furin (also known as PACE), a ubiquitously expressed endoprotease in the Golgi apparatus and endoplasmic reticulum (ER), recognizes and cleaves TAT-PTD and some of the reprogramming factors during secretory transition processes. To circumvent this problem, we introduced the mutated sequences to all the furin-recognition sites within TAT-PTD, c-MYC, and SOX2. It has been previously reported that PTD-4, a mutant form of TAT-PTD (we call it TAT4.), shows highly improved efficiency in transducing the bioactive molecules and none of the furin-recognition sequences are found in its peptide sequence. Therefore, we thought that TAT4 peptide can be theoretically applied to our system for the transduction of secreted recombinant proteins with high efficiency. Unlike other reprogramming factors, OCT4 can be secreted through Golgi apparatus and ER without degradation, because it doesn't contain furin-recognition sequences. However, since c-MYC, SOX2, and KLF4 can be susceptible to proteolytic processing by furin or furin-like proteases, we introduced some mutations into c-MYC and SOX2 to make them furin-resistant: R367K and R424Q for c-MYC, R43Q and R114Q for SOX2. Finally, we utilized a reprogramming factor, KLF5 as a substitute for KLF4 having a furin-recognition site at amino acids R374-R377. Based on the above-described modifications, we finally constructed the expression vectors encoding furin-resistant reprogramming factors and established stable transformant cells, SNLs secreting the transducible four reprogramming factors.

With SP-SNLs, as feeder cells secreting transducible reprogramming factors and recombinant protein producer cells, we succeeded in generating mouse iPSCs from mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and human iPSCs from human dermal fibroblasts (HDFs) with high efficiency and without extended generation time compared with viral-transduction. Additionally, we also succeeded in generating human iPSCs from human cord blood CD34+ progenitors. From these iPSCs generations, we confirmed that furin-resistant reprogramming factors could generate iPSCs more efficiently than furin-sensitive ones. These iPSCs generated with SP-SNLs and secreted transducible reprogramming factors had basic characteristics of a pluripotent population.

In conclusion, we have demonstrated that direct delivery of reprogramming proteins by feeder cells can avoid the potential risks of transgenic insertions and will provide greater insight as to the beneficial roles in regenerative medicine.

本研究は体細胞から多能性幹細胞の誘導を誘導するために、Genomic Integrationやそれによる危険性を内在するウィルスベクターを使用せずに、初期化因子を融合蛋白として導入する。初期化因子の融合蛋白は哺乳類細胞から分泌させ、その初期化因子が体細胞に導入されるようにProtein Transduction Domain (PTD)を応用する。最終的には体細胞を細胞導入型初期化因子を分泌する哺乳類細胞と共培養することによって、多能性幹細胞の誘導を目指す。この多能性幹細胞の誘導方の開発から、下記の結果を得ている。

1.CMV プロモーターの下流に分泌のシグナルペプチドであるIg kappa leader sequenceやPTDの配列を融合させ、その下流に初期化因子である、c-MYC, OCT4, SOX2, KLF5をそれぞれ融合させた。しかし、Ig kappa leader sequenceによる分泌は、Golgi apparatusやEndoplasmic Reticulum (ER)を経由し行われるがこの段階でfurinによって蛋白が分解されるのが予想できる。Furinによる分泌段階での初期化因子の分解を考慮し、その認識配列をPoint Mutationさせ、分解されないように期待した。その結果、分泌されたあとの初期化因子融合蛋白として、TAT4-c-MYC, TAT4-OCT4, TAT4-SOX2, TAT4-KLF5を, そして、furin耐性の蛋白としてTAT4-c-MYC R367K R424Q、TAT4-SOX2 R43Q R114Qを使用した。

2.この蛋白を分泌する発現ベクターをSNL細胞にTransfectionし、Zeocin処理によって細胞株、SP-SNLs、を作成した。このSP-SNLs細胞を用いて、Western Blootingや免疫染色を行い、SP-SNLsが分泌している融合蛋白とMutantの蛋白がFurinへの耐性を持っている性質を確認した。

3.それぞれの初期化因子の融合蛋白を分泌するSP-SNLsを用いてMouse Embryonic Fibroblasts (MEFs)からマウスiPS細胞を樹立することに成功した。この時、SP-SNLs細胞はiPS細胞の樹立のためのFeeder細胞として使用した。この実験から、細胞導入型初期化因子を分泌するSP-SNLsがiPS細胞の誘導に効果があるのを確認した。その後は、Oct4のプロモーターの活性化によってEGFPを発現するMEFs細胞を用いてiPS細胞の作成を行い、EGFP陽性のコロニーの数や未分化マーカーであるSSEA-1陽性のコロニーの数を確認し、furin-sensitiveとfurin-resistantの初期化因子の融合蛋白のiPS細胞誘導能を比べ、furin-resistantの蛋白の場合がより高い効率と早いスピードで樹立ができる事実を確認した。

4.マウス細胞からのiPS細胞の樹立ができることを確認した上、次はヒトiPS細胞の樹立を行った。同じく、SP-SNLs細胞をFeeder細胞として使用し、Human Dermal Fibroblasts (HDFs, neonate)からヒトiPS細胞の樹立に成功した。樹立されたiPS細胞でCharacterizationを行い、融合蛋白から樹立されたこのiPS細胞が多能性幹細胞であることを確認した。

5.次は、TAT4-c-MYCやTAT4-c-MYC R367K R424Qを除いた3因子を用いてHDFsからヒトiPS細胞の樹立に成功した。最後に、Human Cord Blood CD34+ Progenitorからの樹立にも成功した。

以上の結果から、本論文はウィルスベクターやPlasmid DNA, そして、分離精製する必要のある融合蛋白などを利用せずに、細胞導入型初期化因子を分泌する細胞を用いるiPS細胞の樹立方法を開発し、分泌段階でのfurinによる分解を回避することによってiPSの誘導がより高い効率で、そして、ウィルスと比べ遅くないスピードで早く樹立ができる事実を明らかにしたと判断する。