Influenza is a major public health concern, causing annual epidemics with considerable morbidity and mortality worldwide, and sporadic pandemics. The influenza A virus genome comprises eight single-stranded RNA segments. This feature allows genetic reassortment, which is important for influenza virus evolution, contributing to the genesis of pandemic influenza viruses via antigenic shift. A thorough understanding of the factors that govern reassortment is, therefore, essential to our ability to predict and respond to future influenza pandemics.

Since 1997, highly pathogenic avian H5N1 influenza viruses have consistently crossed the species barrier and infected humans with a high lethality rate, and it is feared that they could acquire the ability to transmit efficiently among humans, possibly through reassortment, thus acquiring pandemic potential. The emergence of the pandemic (H1N1) 2009 influenza A virus (pdm2009) may represent a new opportunity for such reassortment. Moreover, the possibility of enhanced virus growth of pdm2009 through reassortment with contemporary seasonal viruses cannot be overlooked.

With the ultimate goal of shedding light on the factors that may shape the emergence of the next pandemic virus, I have studied different aspects of reassortment in influenza viruses, with an emphasis on the genetic compatibility between pdm2009 virus and contemporary seasonal viruses and highly pathogenic avian H5N1 influenza viruses. By co-infecting cells with pdm2009 and a contemporary human H5N1 virus isolate I found that these two viruses had a high level of genetic compatibility, since about 85% of the resulting progeny virions were reassortants. A replicon assay showed that all possible combinations of the ribonucleoprotein complex components between the two viruses had substantial activity, and studies in human airway epithelium cell lines revealed that reassortants between pdm2009 and H5N1 viruses had high growth capability, with some reassortants showing enhanced growth kinetics in human lung cell lines relative to the wild-type parental viruses. These findings suggest that upon co-infection of a susceptible host with pdm2009 and H5N1 viruses, reassortment is likely to occur, with the possible generation of pandemic H5N1 viruses. Moreover, reassortant viruses produced by using reverse genetics that contained the HA of a seasonal H1N1 virus and the NA and M genes of pdm2009 virus showed enhanced growth capability over their wild-type parental viruses, suggesting that the emergence of such viruses could also represent a threat. However, a factor that restricted influenza virus genetic reassortment was also identified, because a polymerase complex containing a pdm2009 PB2 on a seasonal H1N1 virus background showed restricted polymerase activity that led to impaired virus viability. The results of adaptation experiments and a replicon assay pointed to the cooperation between PB2 and PB1 as a restricting factor for reassortment of influenza viruses.

The research I present here contributes to our understanding of the factors that govern reassortment in influenza viruses. This knowledge may provide insights into the future of pandemic influenza, thereby allowing more effective surveillance, preparedness, prevention, and control measures.

本研究はインフルエンザウイルスの遺伝子交雑およびパンデミックウイルス出現の機構をより深く追究するため、培養細胞を用いた種々の手法により2009パンデミック(H1N1)インフルエンザウイルス、高病原性H5N1鳥インフルエンザウイルス、および季節性インフルエンザウイルスの相互の遺伝的親和性の解析を試みたものであり、下記の結果を得ている。

1.培養細胞にH5N1鳥インフルエンザウイルスおよび2009パンデミックインフルエンザウイルスを同時に感染させたところ、感染細胞から放出された子孫ウイルスの中に感染させた二つのウイルスの遺伝子を様々な組み合わせで持つ組み換え型ウイルスが存在していた。また、組み換え型ウイルスは高い比率で存在しており、このことから、自然界においてもH5N1鳥インフルエンザウイルスおよび2009パンデミックインフルエンザウイルスの同時感染により組み換え型ウイルスが容易に生じる可能性が示唆された。

2.リバースジェネティクス法により、H5N1鳥インフルエンザウイルスと2009パンデミックインフルエンザウイルスとの間でウイルスRNAポリメラーゼ関連遺伝子を入れ替えた組み換え型ウイルスを作製した。これらの組み換え型ウイルスの増殖能力を測定したところ、いずれの組み換え型ウイルスも高い増殖能力を有しており、H5N1鳥インフルエンザウイルスおよび2009パンデミックインフルエンザウイルスとの間で遺伝子交雑がなされることによって新たなパンデミックインフルエンザウイルスが出現する可能性が示唆された。

3.H5N1鳥インフルエンザウイルスおよび2009パンデミックインフルエンザウイルスのウイルスRNAポリメラーゼ構成要素を組み合わせて組み換え型ウイルスRNAポリメラーゼを作製し、活性をレプリコンアッセイにより測定したところ、すべての組み合わせにおいて組み換え型ウイルスRNAポリメラーゼは活性を有していた。このことから、H5N1鳥インフルエンザウイルスと2009パンデミックインフルエンザウイルスとの遺伝的親和性が高いことが示唆された。

4.2009パンデミックインフルエンザウイルスおよび季節性H1N1インフルエンザウイルスの遺伝子を組み合わせて組み換え型ウイルスを作製し、増殖能力を測定したところ、季節性H1N1インフルエンザウイルスのHA遺伝子と2009パンデミックウイルスのNAおよびM遺伝子を合わせ持つ組み換え型ウイルスは組み換え前の二種類のウイルスよりも高い増殖能力を有することが明らかとなった。このことから、2009パンデミックインフルエンザウイルスと季節性H1N1インフルエンザウイルスとの遺伝子交雑は新たなパンデミックインフルエンザウイルスが出現する原因となり得ることが示唆された。

5.ウイルスと細胞との親和性の調査およびウイルス粒子の電子顕微鏡観察により、組み換え型ウイルスの増殖能力の高さに関係し得るような細胞への吸着能力やウイルス粒子の形状の違いが明らかとなった。

6.2009パンデミックインフルエンザウイルスおよび季節性H1N1インフルエンザウイルスとの間で組み換え型ウイルスRNAポリメラーゼおよび組み換え型ウイルスを作製し、それらの活性および増殖能力をそれぞれ測定したところ、2009パンデミックインフルエンザウイルスのPB2タンパク質と季節性H1N1インフルエンザウイルスのPB1タンパク質を含む組み換え型ウイルスRNAポリメラーゼの活性は低く、そのようなウイルスRNAポリメラーゼを持つ組み換え型ウイルスの増殖能力も低いことが明らかとなった。このことから、2009パンデミックインフルエンザウイルスおよび季節性H1N1インフルエンザウイルスとの間には遺伝的な不和が存在することが示唆され、このような遺伝的不和はインフルエンザウイルスの系統間の遺伝子交雑における制限要素であると考えられる。

以上、本論文は2009年パンデミック(H1N1)インフルエンザウイルスと現在流行しているインフルエンザウイルスについて、ウイルスの遺伝子交雑に関与する因子を明らかにした。本研究はパンデミックインフルエンザウイルスの再出現に関与し得る新規かつ重要な分子機構を呈示するものと考えられ、学位の授与に値するものと考えられる。