RhoA plays a pivotal role in regulating cell shape and movement. It has been shown that protein kinase A (PKA) inhibits RhoA signaling and thereby induces characteristic morphological change, cell rounding. This has been considered to result from cAMP-induced phosphorylation of RhoA at S188, which increases the affinity of RhoA to RhoGDIα, induces stable RhoA-RhoGDIα complex, and sequesters RhoA to cytosol. Although nearly stoichiometrical phosphorylation of RhoA has been demonstrated biochemically, only few reports have detected phosphorylation of endogenous RhoA in intact cells. In cardiac fibroblast, we have observed that even cells transfected with constitutively active and phosphoresistant RhoA (RhoA-G14V/S188A) shows cAMP-induced cell rounding when RhoGDIα is coexpressed. Knockdown of RhoGDIα by siRNA cancels cAMP-induced cell rounding. Although cell rounding recovers when RhoGDIα-WT are expressed in these cells, it does not recover when RhoGDIα-S174A are expressed. We further found that PKA phosphorylates RhoGDIα at S174 and phosphorylation of RhoGDIα (but not that of RhoA) is likely to induce the formation of active RhoA-RhoGDIα complex. These data suggest that phosphorylation of RhoGDIα at S174 plays an essential role in PKA-induced inhibition of RhoA signaling and morphological change in cardiac fibroblasts. Our results thus reveal a principal molecular mechanism underlying Gs/cAMP-induced crosstalk to Gq/G13/RhoA signaling

本研究はcAMPに反応し細胞が形を小さく変える現象(cell rounding)の分子機構を、主にcardiac fibroblastで示したものであり、下記の結果を得ている。

1.活性型RhoA(G14V;constitutively active mutant)をbaseに、PKAによるリン酸化サイトとされているSerin 188をAlaninに置換したリン酸化resistant mutant(G14V/S188A)発現細胞において、十分なRhoGDIαが発現していれば、cAMPによってcell roundingが生じるというRhoA S188のリン酸化だけでは説明できない現象を観察した。

2.Endogenous RhoGDIαをsiRNAでknock down することでcAMPによるcell roundingが抑制されることを示した。

3.2.で示したsiRNAでendogenous RhoGDIαをknock downした状態で、siRNAに干渉されないRhoGDIα-WTまたはS174A mutantを発現させcAMPを作用させると、リン酸化を受けうるRhoGDIα-WTではcell roundingが回復したが、リン酸化されないRhoGDIα-S174Aではcell roundingは回復しなかった。このことよりcell roundingにはRhoGDIαのS174のリン酸化が重要な役割を示していることが示唆された。

4.免疫沈降したRhoGDIαをRhoGDIα-S174のリン酸化抗体でwestern blottingしたところ、Endogenous RhoGDIα-S174のintact cellでのリン酸化をcardiac fibroblastで確認した。

5.COS7細胞において、活性型RhoAの免疫沈降時に共沈されるRhoGDIαを評価することで、cAMPによる活性型RhoAとRhoGDIαの親和性の上昇を規定するのが、RhoAのリン酸化よりもむしろRhoGDIαのリン酸化であることを示した。

以上、本論文はcAMPに反応し細胞が形を小さく変える(cell rounding)現象について、リン酸化されたRhoGDIαS174がcell roundingの責任分子であることを明らかにした。本研究はcAMPによるRhoAの抑制は、これまでRhoA-S188がリン酸化されることが主たる分子機構と考えられていたが、cAMPの上昇に伴ってRhoGDIα-S174がリン酸化されることがRhoAの抑制の主たる分子機構であるという事象を明らかにしたという点で、学位の授与に値するものと考えられる。