Tuberous sclerosis complex (TSC) is an autosomal dominant neurocutaneous syndrome caused by mutations in either of the two tumor suppressor genes TSC1 or TSC2, which encode TSC1 (hamartin) and TSC2 (tuberin), respectively. TSC is clinically characterized by seizures, mental retardation, behavioral disturbances, and hamartomatous lesions in many organs. TSC1 and TSC2 form a complex that negatively regulates the mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1) activity by inhibiting Rheb. The active form of Rheb enhances phosphorylation of mTORC1 substrates S6K and 4E-BP1, and promotes cell growth and proliferation. In upstream of TSC1/2, Akt is one of the inhibitor of TSC1/2. The different evidences for separable functions of TSC1 and TSC2 have been provided. However, very little is known about the function of TSC1 compared with TSC2. The Rho family of small GTPases (Rho, Rac and Cdc42) have effects on the actin cytoskeleton, and play a role in cell polarity, migration and proliferation. Recent studies suggest that TSC1 and TSC2 regulate the activities of Rho family small GTPases, Rac1 and Rho, and the ensuing actin cytoskeletal organization at focal adhesion. However, how TSC1 contributes to the establishment of cell polarity has not been well known. Here, I analyzed TSC1 function focusing on small GTPase and actin fiber remodeling, using originally established mice renal tumor cell line. First, I established stable TSC1-expressing cell lines from a Tsc1-deficient mouse renal tumor cell line. mTORC1 signaling pathway activated by Tsc1-deficiency cells was suppressed by restoration of TSC1. I also observed the increase in p-Akt levels by TSC1 expression, indicating that a negative feedback loop was enhanced during renal tumorigenesis in Tsc1 knockout mice. TSC1 inhibited cell proliferation, but not cell growth in this study. Cell migration was suppressed when TSC1 was expressed. In addition, Rac1 activity, as well as the formation of lamellipodia and filopodia, was decreased. These results indicate that cell migration was inhibited by TSC1, which likely result from the reduction of filopodia and focal adhesion. To my knowledge, this is the first report of TSC1 function on cell migration in mammalian epithelial cells. In the confluent monolayer, apical actin fibers which aligned and traversing the cell body from one side to the other appeared in the apical region of TSC1-expressing cells. This apical actin network seemed to connect with cortical actin at the level of tight junction. A report demonstrated that radially organized actin fibers appeared under the condition of inhibition of cell-cell junction formation. In contrast, cell-cell junction in TSC1-expressing cell was not remarkably changed from that in TSC1-deficient cells in my result. I speculate that the formation of apical actin network is not directly related to the assembly and disassembly of cell-cell junctional complexes. From the observation that fibers were arranged as if they were intercellularly connected, functions of apical actin network are suggested to be coordinated between different cells. Thus, apical actin network found in TSC1-expressing cells might be a structure for the regulation of cell morphology or permeability in renal epithelial cells. This apical actin network was markedly decreased by ROCK inhibitor treatment. Hence, it was not reduced by either short-term or long-term rapamycin treatment. These results suggest that the apical actin network is regulated by Rho-ROCK pathway independently of mTOR1 and mTORC2. Likewise, actin stress fibers in the basolateral side of cells were also decreased by ROCK inhibitor treatment in both of TSC1-deficit and -expression cells. Although the amount of active RhoA in whole cell was not increased in my assay, it is possible that spatial regulation of RhoA localization is regulated by TSC1. In addition, downregulation of Rac1 found in TSC1-expressing cells may also contribute to apical actin network. RhoA promotes apical constriction through the production of phospho-myosin regulatory light chain, whereas Rac1 suppresses this function of RhoA. Thus, my results suggest that the apical actin network in TSC1-expressing cells is induced by predominance of RhoA on Rac1 activity. I conclude that TSC1 may regulate the actin cytoskeleton via novel pathway, thereby play a role in polarity-related morphological regulation.

結節性硬化症は、常染色体優性遺伝形式をとる神経皮膚症候群で、多臓器にできる良性腫瘍と精神発達遅滞、てんかん、自閉症などの神経症状が特徴である。原因遺伝子であるTSC1とTSC2は腫瘍抑制遺伝子で、それらは複合体を形成してmTORを抑制することにより、細胞増殖、細胞成長などを制御している。

本研究では、このうちTSC1の機能を明らかにするため、ノックアウトマウスの腎がん細胞から樹立したTSC1 欠損の培養細胞株にTSC1を発現させた安定細胞株を作成し、これを用いてTSC1の機能を解析したものであり、以下のような結果を得ている。

1.本研究で独自に樹立したマウス腎がん細胞で、TSC1が欠損していることにより亢進していたと思われるmTORシグナル伝達系が、TSC1を発現させることによって抑制されていることがウェスタンブロッティングにより確認された。

2.細胞を同数まいて経時的に細胞数をカウントし、増殖する様子を観察したところ、TSC1を発現させた細胞で細胞増殖は抑制されていた。XTT アッセイでも同様の結果が得られており、TSC1は細胞増殖を抑制することが示された。

3.フローサイトメトリーを用いて細胞の大きさを解析したところ、TSC1を発現させても細胞の大きさには変化が認められなかった。

4.活性型のRhoファミリー低分子量Gタンパク質のRac1、RhoAにそれぞれ結合するビーズを用いたプルダウンアッセイでは、TSC1を発現させることによりRac1の活性は低下し、RhoAの活性は変化しないことが示された。

5.TSC1により細胞移動が抑制されることが、スクラッチアッセイによって示された。

6.蛍光タンパクを結合させたphalloidinでアクチン骨格を染色し、共焦点顕微鏡で観察したところ、細胞移動の際、先導端(leading edge)でのアクチン骨格の走行方向がTSC1によって変化していることが示された。またTSC1発現細胞では糸状仮足(filopodia)や葉状仮足(lamellipodia)の形成が低下していた。また、接着班(focal adhesion)の構成タンパクに対する免疫染色で、接着班が減少していることが示された。

7.コンフルエントな単層な部分ではTSC1を発現させた細胞において、TSC1欠損細胞にはみられない、細胞の頂端側に細胞を横切るように走行する比較的整列した細いアクチン線維が出現していた。共焦点顕微鏡を用いてZ方向へ連続的に解析したところ、このアクチン線維がタイトジャンクションの構成タンパクであるZO-1と一致する高さに存在しており、タイトジャンクションと関連したアクチン線維である可能性が示された。

8.mTORの阻害剤であるrapamycinと、RhoAのエフェクターであるROCKの阻害剤であるY27632で細胞を処理すると、Rapamycinでは細胞の頂端側のアクチン骨格に変化は認められず、Y27632ではTSC1発現細胞でみられた細い線維は著明に減少していた。したがって、TSC1は細胞全体のRhoAの活性には大きな変化をもたらさず、細胞の頂端側での活性を制御することにより頂端側のアクチン骨格形成に関与していると考えられた。

以上、本論文はTSC1ノックアウトマウスの腎がん細胞にTSC1を発現させた安定細胞株において、TSC1は低分子量Gタンパク質の活性制御を介してアクチン骨格を制御することにより、細胞移動や細胞極性に対して機能していることを明らかにした。TSC2に比べTSC1の機能はまだ不明な点が多く、特に細胞移動や細胞極性に関する機能はほとんどわかっておらず、本研究はTSC1の機能解明に重要な貢献を成すと考えられ、学位の授与に値するものと考えられる。