This dissertation contributes to the enhancement of the functionality of nucleic acids/ polyion complexes delivery systems. Nucleic acids, such as plasmid DNA (pDNA) and short interfering RNA (siRNA), are promising bioactive macromolecules engaged actively in the gene therapy and RNA interference (RNAi) approaches for a potential successful treatment of cancers. Nevertheless, for their effective application in cancer therapy, hurdles of the instability of their naked molecules and/or their delivery systems and their poor cell uptake need to be overcome. Polyion complexes (PICs) prepared from electrostatic interactions between the anionic nucleic acids and cationic polymers are advantageous over other delivery systems in being capable of dynamic associative-dissociative conversions for the loading and release of the nucleic acids. Hitherto, instability of PICs in biological milieu due to immature dissociation or aggregation is still problematic.

This study investigates the concept of shielding the PIC surface by a silica coating layer to enhance its stability and biological activity. The dissertation is commenced by an introductory chapter pertaining to a literature survey of the main concepts upon which this research is based: nucleic acids properties, therapy approaches and clinical applications in cancer treatment, overview of nanoparticle delivery systems with a special emphasis on PIC systems and silica-based systems. The body of the thesis is concerned with two types of PIC systems explored for silica coating: a pDNA/PIC (chapter 2) and a core-shell cross-linked siRNA/PIC micelles system (chapter 3), before elucidating the final conclusions and perspectives in chapter 4.

Chapter 2 results showed a superior effect of silica coating on stability and transfection efficiency for the examined pDNA/polyarginine (PArg) PICs. The pDNA/PArg PICs prepared via the electrostatic interaction between anionic pDNA and cationic PArg were successfully shielded by a silica coating via the condensation of the negatively charged silicic acid and produced negatively charged PICs in the range of 100 nm. The silica coated PICs were stable in the presence of a counter polyanion dextran sulfate. This stabilizing effect was proved to be reversible and to enhance the PIC transfection efficiency on a hepatoma cell (HuH-7).

This successful silica coating of pDNA PICs encouraged testing the same concept on siRNA PICs in Chapter 3. The template PICs were formed by the interaction between anionic siRNA and poly(ethylene glycol)-block-poly(L-lysine) with a mercaptopropylamidine side chain (PEG-b-PLL(MPA)) to form disulfide-crosslinked core-stabilized PIC micelles with a small size and a narrow size distribution. The applied silica coating resulted in the formation of silica-coated PIC micelles (SCM) with a size less than 120 nm and a narrow size distribution (polydispersity index < 0.2). Transmission electron microscopy (TEM) and energy dispersive-x-ray scanning TEM confirmed the presence of silica layer on the SCM surface. Surface shielding of core-stabilized PIC micelles increased their stability in presence of counter polyanions. The stabilizing effect did not interfere with the environment sensitivity of this PIC system, i.e., disulfide cleavage in reductive environments. The obtained silica-coated systems allowed good cell viability even at the highest concentration tested (500 nM siRNA) against a cervical carcinoma cell (HeLa), and further, they significantly improved gene silencing efficiency up to 28 % in comparison with non-coated PICs (NSCM) in spite of the significantly lower cellular uptake in 3-hour incubation with the cells. Confocal microscopy observation studies with fluorescently labelled siRNA revealed that the colocalization of SCM with the late endosomes /lysosomes was significantly lower than in case of NSCM, suggesting a facilitated endosomal escape of micelles by silica coating and/or different cellular uptake routes between SCM and NSCM. The cellular uptake studies using selective inhibitors and the pulse and chase intracellular trafficking gave more insights on the internalization process of SCM where it appeared that NSCM and SCM had different endocytosis patterns, through which more siRNA could be released in the cytoplasm when applied in the form of SCM. In conclusion, this work is presenting a novel approach to stabilize the nucleic acid-incorporating PICs via silica coating.

The surface shielding of PICs by silica coating seems to provide a reversible stabilizing effect for enhanced delivery efficacy of therapeutic nucleic acids and a promising strategy to improve the functionality of PIC systems for in vivo applications.

遺伝子(例:plasmid DNA, pDNA)及び核酸医薬(例:small interfering RNA, siRNA)は、それぞれ配列に応じて特定遺伝子の発現をup regulationもしくはdown regulationすることから、がんなどの難治性疾患の治療薬として実用化が期待されてきた。しかし、いまだに米国FDA(及び我が国)で承認された遺伝子治療薬・siRNA医薬はない。その最大の要因は、安全かつ効率良く標的とする細胞内に遺伝子・核酸を導入する技術が確立されていないことである。よって、それらを効率良く細胞内にデリバリーするためのキャリア開発に注目が集まっている。遺伝子・核酸キャリアに必要とされる主な機能として、1)遺伝子・核酸の酵素分解を防ぎつつ、生体内で安定にデリバリーし、2)標的とする細胞に取り込まれた後に、分解オルガネラであるエンドソーム/リソソームを回避して細胞質(もしくは核)へと移行し、3)最終的には遺伝子・核酸を放出する機能が挙げられる。本論文では、上記機能を備えたキャリアを開発するために、pDNAもしくはsiRNAとポリカチオンの間で形成されるポリイオンコンプレックス(PIC)に着目し、さらにPICの問題点である生体内での安定性の低さを改善する方法論としてシリカによるPIC被覆を提案している。具体的には、表面が正に帯電したpDNAないしsiRNA封入PICを調製し、それをケイ酸溶液と混合することでPIC表面に負に帯電したシリカ被覆層を形成させ、PICの構造安定化を図っている。シリカ被覆により、PICの構成成分であるポリカチオンと生体成分(主に負に帯電)との非特異的相互作用が抑制され、PICの解離が大きく抑制されることが期待される。その一方で、シリカとケイ酸との間の平衡により、希釈環境下ではシリカ被覆層は徐々にケイ酸イオンへと溶解し、細胞内での遺伝子・核酸放出を妨げないものと考えられる。以下に、各章ごとに対する審査結果の概要を述べる。

第一章の序論では、pDNAとsiRNAの構造的特徴とその医療応用に向けた可能性および克服すべき点を論ずると共に、キャリアの設計指針についてまとめている。特に、キャリアの候補としてPICに注目し、その長所として、構成成分であるポリカチオンの多様なデザインに基づくPIC機能化への高いポテンシャル及び調製の容易さを述べている。一方、改善すべき課題として生体内での低い安定性を指摘しており、これを解決するための方法論として水溶性シリカゲルによるPIC被覆を提案し、シリカの基礎物性や安全性と共に本研究の意義及び妥当性を述べている。

第二章では、PICのシリカ被覆による機能化(安定化)を実証するために、pDNAとポリアルギニン(PArg)の間でPICを調製し、そのシリカ被覆を行っている。PICとケイ酸溶液を混合した後のケイ酸(イオン)分子の減少からシリカの形成を確認し、またPICの粒子径の増大及び表面(ζ-)電位の正から負への反転に基づき、シリカによるPIC被覆を確認している。そして、ポリアニオンであるデキストラン硫酸との混合後のpDNA放出挙動から、シリカ被覆によるPICの可逆的安定化を検証している。すなわち、シリカ被覆なしのPICはデキストラン硫酸の添加によりpDNAを放出し、PICが解離することが確認されるが、シリカ被覆したPICはpDNAを放出しなかったことから、PIC構造の安定化が示された。加えて、シリカ被覆したPICを透析処理した後に同様の実験を行ったところpDNAの明らかな放出が検出されたことから、シリカとケイ酸の間の平衡に基づき、シリカ被覆層が溶解することが示唆された。さらに、培養細胞に対してルシフェラーゼアッセイを行ったところ、シリカ被覆なしのPICに比べ、シリカ被覆したPICは1桁近く高い遺伝子導入効率を達成した。よって、シリカ被覆によるPICの可逆的安定化が可能であり、またpDNAキャリアの性能向上に寄与することが示された。

第三章では、シリカ被覆の方法論をsiRNA封入PICへと拡張している。siRNAは、遺伝子改変を惹起しないことから遺伝子と比べてより実用性の高い核酸医薬として期待されている反面、安定なキャリア調製がより困難であることも知られている。よって、シリカ被覆の方法論が効果的に活用され得ることを強調している。PArgを用いた場合、siRNAの間で均一なPICが調製されなかったため、ここではポリエチレングリコール(PEG)と側鎖に安定化ユニット(メルカプトプロピルアミジン(MPA))が導入されたポリリシン(PLL)のブロック共重合体PEG-PLL(MPA)を用いてsiRNA封入PICミセルを調製し、そのシリカ被覆を行っている。PArg/pDNAのPICと同様に、siRNA封入PICミセルも粒子径の増大及びζ-電位の反転が観察されたことからシリカ層形成を確認している。加えて、PIC表面でのシリカ層形成に関するより直接的な証拠を得るために、走査透過電子顕微鏡(STEM)法を用いて元素分析を行い、シリカ由来のケイ素とsiRNA由来のリンが共局在していることを実証している。また、pDNA封入PICと同様に、siRNA封入PICミセルもシリカ被覆に基づいて可逆的に安定化されること、及び培養細胞に対するRNAi活性が有意に向上することを確認している。さらに、シリカ層形成に伴うRNAi活性向上のメカニズムについて詳細な解析を行っている。考えられる主な可能性として、siRNAの細胞内取り込み量の増加と細胞内動態の改善の二つが挙げられることから、蛍光標識siRNAを用いて、それぞれに関して検証している。取り込み量に関してはシリカ被覆の有無で大きな差が見られなかったことから、細胞内動態に焦点を当て、シリカ被覆されたPICはエンドソーム/リソソームに集積しにくいことを明らかにしている。これを説明する仮説として、過去のシリカ粒子に関する研究を引用しつつ、i)シリカ層自体にエンドソーム膜を選択的に壊す作用があること、及びii)マクロピノサイトーシス経路を介した細胞内移行を挙げている。特にii)に関して、マクロピノサイトーシス経路により取り込まれた高分子物質はリソソームに送達されない可能性が指摘されていることを考慮し、核酸デリバリーに有利な取り込み経路であることを主張している。実際に培養細胞を用いた取り込み阻害実験を通じて、シリカ被覆されたPICミセルは、シリカ被覆なしのPICミセルと比べ、マクロピノサイトーシスを介した細胞内移行量が有意に増加することを実証している。

第四章では、総括として一連の研究結果をまとめると共に、遺伝子・核酸デリバリーにおける展望について述べている。

以上、本論文では、シリカ被覆という方法論に基づいて、PICの可逆的な構造安定化と効果的な遺伝子・核酸デリバリーが可能になることを実験的に明らかにしている。シリカ被覆層の形成を確認するための物理化学的評価に加え、培養細胞を用いた細胞内取り込み量・細胞内取り込み経路・細胞内動態に関する詳細な解析を行い、シリカ被覆に誘起される特異的な細胞内取り込み経路と細胞内動態を見出している。本論文に記された遺伝子・核酸キャリア設計に関する方法論は、難治性疾患の治療薬として世界的に嘱望されている遺伝子治療薬・核酸医薬開発に有意義な知見を与え、バイオマテリアル分野において大きく貢献したものと認められる。

よって本論文は博士(工学)の学位請求論文として合格と判断される。