Introduction

Human leukocyte cell-derived chemotaxin 2 (LECT2) was first purified from the culture supernatants of phytohaemagglutinin-activated (PHA) human T-cell leukemia SKW-3 cells as a chemotactic factor to human neutrophils. LECT2 is preferentially expressed in the adult and fetal livers and in the human hepatoma cell lines. Although LECT2 was originally demonstrated in vitro to have chemotactic activity, accumulating evidences suggest that LECT2 is involved in a more multifunctional role in the liver, extending from cell growth, differentiation, damage/repair process and carcinogenesis to autoimmune diseases. Moreover, the polymorphism of human LECT2 at V58I is associated with the severity of rheumatoid arthritis in the Japanese population. Recently, LECT2 has also been identified as a protein associated with human systemic amyloidosis. In addition, proteins homologous to human LECT2 have been isolated in many other vertebrates, such as bovine (Bos taurus) and chicken (Gallus gallus). Bovine LECT2 is identical to bovine chondromodulin-II, which stimulates the proliferation of chondrocytes and osteoblasts.

The diverse biological functions of human LECT2 are presumably related to its biochemical properties. Human LECT2 is a 16-kDa secreted protein consisting of 133 amino acids and three intramolecular disulfide bonds. Database searches using Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) have indicated that human LECT2 belongs to the zinc metallopeptidase family M23. Members of this family have a preference for peptides containing polyglycine residues, especially Gly-Gly-Xaa, where Xaa is any aliphatic hydrophobic residue. However, the actual biochemical properties of LECT2 and the structural basis for its biochemistry are still unknown. Therefore, the present study aimed to clarify the biochemical and structural characteristics of human LECT2.

Expression, high-pressure refolding and purification of human LECT2

In this study, soluble LECT2 was expressed in E.coli for the first time. However, the amount of soluble expression was very low and large amounts of LECT2 were found in insoluble inclusion bodies (IBs) (Fig. 1). Therefore, high hydrostatic pressure (HHP), which has been widely used as a powerful tool for refolding protein from IBs, was used to refold LECT2 in order to obtain more soluble protein. The structural features of the refolded LECT2 were then evaluated by CD and NMR. The results clearly demonstrated that LECT2 could be refolded into active form using HHP. The tertiary structure (Fig. 2A) and chemotactic activity (Fig. 2B) of the refolded LECT2 were indistinguishable from those of LECT2 which had been solubly expressed and purified. Therefore, refolded LECT2 was used in this study to investigate the structure and function of the LECT2 protein.

The crystal structure of human LECT2

Seleno-L-methionine (SeMet)-labeled LECT2 was crystallized. The optimal crystal was obtained using a reservoir solution consisting of 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M HEPES (pH 7.5) and 25% (w/v) polyethylene glycol 8,000 at 293 K. An X-ray diffraction data set was collected to 1.94 A using a synchrotron X-ray source (PF BL-5A). The space group of the crystal was P212121, with unit-cell parameters a=59.4 A, b=63.5 A and c=64.0 A. The asymmetric unit contains two molecules of LECT2. After phase determination and refinement, the structure of LECT2 was resolved. In this structure, LECT2 is bound to one zinc ion (Zn(2+)), which is four-coordinated by His53, Asp57, His138 and a water molecule (Fig. 3). The structure showed that LECT2 has a fold similar to lysostaphin-type metalloendopeptidase LytM, which is present in bacteriophases and in bacteria, and also shares the conserved sequence motifs HXXXD and HXH.

The metalloendopeptidase activity of LECT2 and the selection of the substrate peptides of LECT2 by phage display screening

Since LECT2 has a structure and active site similar to metalloendopeptidase LytM, it was hypothesized that LECT2 may also have metalloendopeptidase activity. In this study, azocasein and pentaglycine were used as substrates to determine the proteolytic activity and enzymatic specificity of LECT2. However, it was found that LECT2 could not hydrolyze azocasein or pentaglycine, possibly because the positions and lengths of the four loops in the LECT2 structure are somewhat different from that of LytM so that their enzymatic specificities are different.

In order to clarify whether LECT2 could bind certain peptides or proteins and has metalloendopeptidase activity, the Ph.D.-12 phage display peptide library was used to select the peptides that bind to LECT2. The results showed that the binding peptides contain a short consensus sequence of GYPD. Sequence alignment by BLAST revealed that some immune proteins (Homo sapiens) such as T-cell receptor delta chain, immunoglobulin (Ig) heavy chain and C-type lectin domain family 17 (member A, CLEC17A) contain the GYPD motif. Therefore, these proteins are possible receptors of LECT2. The binding of these receptors to LECT2 may be responsible for the chemotactic activity and other biological functions of LECT2.

The comparison of the crystal structure and NMR dynamics of the wild type and mutant LECT2

The polymorphism of human LECT2 at V58I is associated with the severity of rheumatoid arthritis in the Japanese population. In order to investigate this, the LECT2 V58I mutant was expressed and crystallized. However, structural analysis showed that the V58I mutant has the same structure as wild type LECT2.

NMR dynamics of the wild type and mutant LECT2 were also compared. Standard pulse sequences with minimal water suppression were used to record the T1 and T2 relaxation times and the {1H}-(15)N heteronuclear NOEs of the wild type and mutant LECT2. By calculating the R1 and R2 relaxation rates and the NOE values, it was found that the LECT2 V58I mutant is different from the wild type LECT2, especially in the R2 and NOEs. The residues related with these differences are mainly located in the vicinity of the zinc-binding site or the V58I mutation. These results suggest that the V58I mutant is different from the wild type LECT2 in its dynamics, which may be associated with the ability of wild type and LECT2 V58I mutant to induce different severities of rheumatoid arthritis.

Fig. 1. SDS-PAGE analysis of Trx-His6-LECT2 expressed in E.coli. S and I mean soluble fraction and insoluble fraction.

Fig. 2. The 1H - (15)N HSQC NMR spectrum (A) and the chemotactic activity (B) of soluble and refolded LECT2.

Fig. 3. The overall structure of LECT2.

本論文は、好中球走化性因子LECT2の様々な生理活性の基盤となる構造と生化学的機能を解明することを目的とし、高圧巻き戻しによる大量調製法の確立(第2章)、X線結晶構造解析(第3章)、メタロエンドペプチダーゼ活性の評価及び結合ペプチドの探索といった機能解析(第4章)、関節リウマチに関与する一塩基多型SNP(V58I変異)が構造及びダイナミクスに及ぼす影響の解析(第5章)について述べている。

第1章は序論として、LECT2に関するこれまでの先行研究についてまとめている。まず、LECT2 が好中球走化性因子として最初に同定された経緯、配列的な特徴、脊椎動物における保存性を説明し、次にケモカイン活性以外のLECT2が関与する生理活性について説明している。LECT2は151残基からなる塩基性タンパク質として合成されるが、N末端の18アミノ酸からなるシグナルペプチドが切り離され、133残基からなる成熟型タンパク質として細胞外に分泌されて機能する。また、3対のジスルフィド結合をもつ一次構造上の特徴が明らかにされている。LECT2は、細胞の増殖、炎症、免疫調節と発癌に関与する多機能なタンパク質であり、それらの基盤となるLECT2の構造と生化学的機能の解明がこれら生理活性を理解する上で重要であることを述べている。一方、慢性関節リウマチ患者においては、疾病の重篤度が高い患者ほどLECT2の58番目のVal残基がIle残基に置換されている割合が高いことが示されている。このため、V58I変異がLECT2の構造とダイナミクスに与える影響を調べ、SNPと構造多型との関連を明らかにすることを目指している。

第2章では、大腸菌発現系を用いたLECT2の発現、ならびに高圧巻き戻し法を用いた大量調製と精製について述べ、LECT2の大量調製における高圧巻き戻し法の有効性について論じている。タンパク質の立体構造解析には大量の試料が必要であるが、大腸菌を用いて可溶性画分に得られたLECT2の収量は非常に少なかった。そこで200 MPaの高圧処理によりLECT2の封入体からの巻き戻しを行ない、高収量でLECT2を得るための調製系を確立した。また、NMR測定により、巻き戻しLECT2は可溶性発現LECT2と全く同じフォールドであること、Zn(II)がLECT2の立体構造に影響を与えることを明らかにした。さらに、LECT2のケモカイン活性を測定し、可溶性発現及び巻き戻しLECT2のケモカイン活性が同等であることも示した。LECT2はZn(II)結合タンパク質であるが、ZnCl2の添加はケモカイン活性を亢進しないことから、LECT2のケモカイン活性はZn(II)に依存しないと考察している。

第3章では、LECT2のX線結晶構造解析について述べ、構造的な特徴を論じている。LECT2の立体構造を1.94 Aで決定することに成功し、分子中央に活性部位と推定される深いクレフトを有することを明らかにした。クレフトは6本鎖からなる逆平行β-シートとその周辺の4つのループから形成され、H35、D39、H120、水分子がZn(II) に4 配位で結合していることを示した。また、LECT2の構造はM23ファミリーメタロエンドペプチダーゼの構造と類似しているが、クレフトの壁を形成している4つのループはLECT2において異なることを明らかにした。特に、ループ1'はLECT2に独特のジスルフィド結合を形成し、クレフトの一端を遮るように配置していると考察している。さらに、M23ファミリーメタロエンドペプチダーゼの触媒残基として保存されているHis残基がLECT2ではTyr残基(Y86)に置換されていることを見出している。

第4章では、LECT2のメタロエンドペプチダーゼ活性の評価とLECT2結合ペプチドの探索について述べ、LECT2の立体構造に基づいてそれら活性との相関を論じている。メタロエンドペプチダーゼ活性について、LECT2はM23ファミリーメタロエンドペプチダーゼの基質であるpentaglycineに対して活性をもたないことを示した。活性をもたない理由の一つとして第3章で見出されたHis残基の置換に注目してY86H変異体での活性を評価し、Y86H置換で活性が回復しないことを示した。この結果より、もう1つの顕著な構造的な違いとして見出されたループ1'がメタロエンドペプチダーゼ活性に重要な影響を有し、ループ1'は活性部位への基質ペプチドの結合を妨害する可能性を考察している。LECT2結合ペプチドの探索については、12アミノ酸残基からなるペプチドのファージディスプレイ法を用いて、N末端のGYPD配列を同定した。免疫関連受容体T-cell receptor delta chain とprolectinは、N-末端にGYPDシーケンスを含むことから、LECT2 とこれら免疫関連受容体との相互作用の可能性を示した。

第5章では、関節リウマチに関与する一塩基多型SNP(V58I変異)が構造及びダイナミクスに及ぼす影響について論じている。X線結晶構造解析によりLECT2 V58I変異体の立体構造を分解能1.59 Aで決定し、野生型と構造比較を行なっている。その結果、両者の構造には全く違いがないことを明らかにした。一方、LECT2およびV58I変異体のNMR解析により、LECT2のダイナミクスにおける違いを考察している。緩和速度R1、R2、とNOEにおいて変化が見出され、特にR2の変化が最も顕著であった。R2、NOEで変化が観測された残基はクレフト上に位置しており、変異によるダイナミクスと活性との間に何らかの相関がある可能性を示した。

以上、本研究はLECT2及びV58I変異体の構造と機能の相関を明らかにしただけでなく、LECT2の免疫調節機能及びV58I変異と慢性関節リウマチの重篤度との連関を解明する重要な手がかりを提供するものであり、得られた知見は学術上、応用上貢献するところが少なくない。よって、審査委員一同は、本論文が博士(農学)の学位論文として価値あるものと認めた。