Akabane virus (AKAV) is the member of genus Orthobunyavirus, family Bunyaviridae, which is an enveloped tri-segmented negative single strand RNA virus. AKAV can cause reproductive system and nervous system diseases in cattle, sheep, and goat, resulting in significant economic losses in livestock industries. Recently, a large endemic Schmallenberg virus (Akabane-like virus) infection crisis lead to a new concern about etiological importance of this virus group. The new endemic virus suggests relation to climate changes and agricultural developments on the earth. Although bunyaviruses are the largest family of viruses and affect a wide range of hosts (human, animals, and plants), we have not attained detailed knowledge about virus-host cell interactions through virus entry into cells to release from cells. The present study performed molecular biological approaches for this fundamental question on AKAV infection, contributing one to establish control measures against bunyavirus infections including AKAV .

In Chapter 1, I evaluated AKAV entry mechanisms using chemical inhibitors of different endocytic pathways, and localization assays were performed for a comparative analyses between non-bovine derived cell lines (Vero cells, HmLu-1 cells and BHK cells) and bovine derived cell lines (LB9.K cells and MDBK cells) endocytosis mechanisms during AKAV infection. The results showed that AKAV penetrates into non-bovine derived cell lines with relation to the classical clathrin-dependent endocytic pathway. By contrast, AKAV entry into bovine derived cell lines required lipid-raft and dynamin. However clathrin, caveolae, actin, microtubule and Arf were not required in this entry process. These results suggest that AKAV entry involved in a novel endocytic pathway. In addition, I demonstrated that endosomal low pH environment was required for uncoating process after AKAV uptake into the cell. No difference on AKAV entry mechanism was observed between different pathotyped strains such as OBE-1 (low pathogenicity) and Iriki (high pathogenicity) strains.

In Chapter 2, I showed the role of actin and microtubule of host cell in AKAV entry, internalization trafficking, replication and assembly steps. The LB9.K cells were treated with cytochalasin D (CytD; actin inhibitor), nocodazole (NOC; microtubule inhibitor), and Brefeldin A (BFA; GTPases of the ADP-ribosylation factor (Arf) family inhibitor and ER-Golgi transport protein inhibitor) at various time points upon AKAV infection. The results showed that neither actin nor microtubule was required for AKAV entry and trafficking to replication compartment. However, I observed that both microtubule and ER-Golgi transport protein were essential for AKAV replication and assembly. Immunofluorescense antibody (FA) microscopic analyses revealed displaced AKAV N protein from perinuclear region in NOC- and BFA-treated cells, indicating that AKAV N transport was inhibited. Also, NOC and BFA treatment affected Golgi compartment position as well. These results demonstrated an essential role of microtubule during AKAV replication and assembly in LB9.K cells.

In Chapter 3, I described the binding property between a regulatory factor of mitochondrial transport, trafficking kinesin-binding protein 2 (TRAK2), and AKAV NSm, which is a viral nonstructural protein encoded by M segment, as revealed by yeast two-hybrid screening assay. In this study, I showed interactions between bTRAK2 and NSm by GST-tag and FLAG-tag pull down assays. Mapping of the binding domain showed that the AKAV NSm interacts with C-terminal domain of bTRAK2, giving a new insight into NSm function of orthobunyavirus replication and assembly events. FA analysis revealed co-localization of bTRAK2 and NSm interaction in perinuclear area where AKAV virions are assembled.

In Chapter 4, I described amino acid difference of the AKAV NSs, which is a viral S segment-encoded nonstructural protein, between OBE-1 and Iriki strains leading to different interferon (IFN) antagonism. The previous study has shown that the NSs of low pathogenic OBE-1 strain rather suppressed IFN action more than 80 times as compared with the NSs of high pathogenic Iriki strain. It is unknown that this functional difference between the NSs may relate with AKAV pathogenicity. Amino acid sequence alignment revealed different residues at three positions of the NSs between OBE-1 and Iriki strains (T for OBE-1 and I for Iriki (T/I) at position 73; F/S at position 85, and T/I at position 86). To determine which residues are responsible for alteration of IFN antagonistic properties between two AKAV strains, I first produced a reassortant AKAV virus (named rIIO), in which L and M segments are derived from Iriki strain and S segment are from OBE-1 strain, by our reverse genetic system with T7 RNA polymerase. I further generated a series of (a total of 6) NSs mutants with single or double amino acid substitutions in the rIIO virus, and compared their growth kinetics, plaque sizes, and IFN-inducible Mx1 RNA expression in LB9.K cells. All of these mutant viruses showed no difference between plaque sizes, but grew more slowly than wild-type (wt-)Iriki virus. qRT-PCR analysis indicated that a mutant virus with amino acid substitution from threonine to isoleucine at position 73 of the NSs stimulated the host Mx1 mRNA level similar to wt-Iriki, indicating that amino acid at this position of the NSs plays a role in different antagonistic properties between OBE-1 and Iriki strains.

In this study, I described the multiple AKAV entry mechanisms and the essential role of microtubule and ER-Golgi transport protein during AKAV replication and assembly, providing to better understand host cellular responses during virus infection and leading to design antiviral drugs targeted for these unique mechanisms in the future. Study of interaction between TRAK2 and NSm might be a first step to enlightenment further study in relation of mitochondria and AKAV infection. Moreover, it is now clear that one amino acid mutation of the NSs leads to show different host interferon response between OBE-1 and Iriki strains. Together, our findings for molecular dissection on AKAV infection might be able to contribute to understand AKAV different pathogenicities between 2 strains as well as the new emerging AKAV-like virus, hopefully leading to establish control measures against bunyavirus infections.

アカバネウイルス(AKAV)はブニヤウイルス科オルトブニヤウイルス属に分類され、三分節マイナス鎖RNAゲノムをもつエンベロープウイルスである。この科には人に強い病原性をもつクリミアコンゴ出血熱ウイルスなどが含まれるが、動物に対しても病原性を示すウイルスが数多く分類されている。AKAVの感染によるアカバネ病はわが国の畜産において重要な疾病の一つであり、牛やめん山羊に繁殖障害(死流産、新生子奇形)を引き起こし多大な経済的損失を発生させる。一方、最近ヨーロッパで、AKAVに類似した新奇のブニヤウイルスが出現し多数の家畜が犠牲となった。このようにブニヤウイルスの感染は新興感染症という見地からも畜産業における地球規模での脅威となっている。しかし、その感染制御法や疾病予防・治療法の開発に必要となるウイルス学的な知見は十分には得られていない。本論文では、AKAVの宿主細胞への感染機構について、ウイルスと細胞因子との相互作用の解析に焦点を絞り研究を行った。

第一章では、AKAVの細胞侵入機構について解析した。エンベロープウイルスの多くは細胞レセプターに吸着し、エンドサイトーシスによりエンドソームに取り込まれ、エンベロープとエンドソームとの膜融合を経て遺伝物質が細胞質内に侵入する。いくつかのブニヤウイルスでも同様な機構が報告されているが、AKAVに関する情報はない。申請者は、各エンドサイトーシス経路を特異的に阻害する薬剤を利用しAKAVの侵入動態を解析した。その結果、非牛由来の培養細胞ではクラスリン依存性経路でウイルスが侵入するのに対し、牛由来の培養細胞ではクラスリンに依存しないことを発見した。さらに、牛由来細胞への侵入はラフトとダイナミンに依存し、カベオラ、微小管などは必要としないこと、ウイルスの脱殻には低pHのエンドソーム環境が重要であることを発見した。また、AKAVの強毒株と弱毒株の間には細胞侵入機構に違いが見られないことを証明した。これらの成績は、他のブニヤウイルスとは異なるAKAVのユニークな細胞侵入機構を示唆しており、今後の解析に新たな手掛かりを提供する知見である。

第二章では、AKAVの侵入から粒子組立てまでの細胞内動態を解析した。申請者は、他のウイルスで重要性が示されている細胞骨格因子の役割に焦点を絞り、牛由来細胞を用いて、阻害薬剤処理に伴う動態変化をウイルスRNA量やウイルス蛋白質の局在変化を指標に解析した。これらの解析手法は申請者自ら標準化した。その結果、アクチンや微小管はAKAVが細胞内に侵入しゲノム複製部位までの輸送過程には必要ではないが、微小管とER-Golgi輸送因子はゲノム複製から粒子組立て過程に必要であることを発見した。これらの成績は、AKAV感染における細胞骨格因子、特に微小管の重要性を初めて報告するものであり、ブニヤウイルス複製機構の全体像解明に寄与する知見である。

第三章では、AKAVの複製分子機構の一端を明らかにする目的で、ウイルス蛋白質NSmと細胞性因子との相互作用を解析した。M分節ゲノムにコードされる非構造蛋白質NSmはウイルスの複製効率に関与し、ミトコンドリア輸送制御因子TRAK2と相互作用する。申請者は、牛細胞由来bTRAK2とNSmの結合性状の解析のためGSTやFLAGタグを付加しプルダウンや局在解析を実施した。その結果、NSmはbTRAK2の中央領域に結合すること、両者はウイルス組立ての場である核周囲領域に共局在することを発見した。これらの知見は、AKAVの複製にミトコンドリアが関与するというユニークなウイルス増殖機構の存在を初めて示唆するものである。

第四章では、AKAV感染に伴う宿主応答の分子機構の一端を明らかにする目的で、ウイルス蛋白質NSsについて解析した。S分節にコードされる非構造蛋白質NSsにはインターフェロンIFN拮抗作用があるとされる。申請者は、この作用がウイルス病原性を規定している可能性を考え、強毒株と弱毒株のNSs間にあるアミノ酸の相違に着目した。リバースジェネティクス法によりNSsに種々の変異をもつ組換えウイルスを作製し、増殖性状とIFN誘導性Mx1遺伝子発現について解析した。その結果、NSsの73番目のアミノ酸が牛由来細胞におけるIFN拮抗作用を制御していることを発見した。今後、シグナル伝達における細胞性因子との相互作用の解析によりAKAVの病原性発現機構の解明につながる成果である。

以上本論文により、AKAV独自の感染侵入機構、細胞内動態、およびそれらを制御するウイルス側因子と細胞性因子との相互作用、さらには病原性発現機構の一端が初めて明らかとなった。これらの成果は、AKAV等ブニヤウイルス感染機構の解明、ひいてはそれらの感染防御法や治療法の開発に多大な貢献を示すのみならず、ウイルス学の新たなブレイクスルーとなる内容も含んでいる。つまり、学術上獣医学のみならず医学への貢献も少なくないと判断する。よって、審査委員一同は本論文が博士(獣医学)の学位論文として価値あるものと認めた。