Unraveling the underlying mechanism and key factors in controlling the differentiation of stem cell is one of the major areas in stem cell research. Coaxing stem cells into specific cell lineages with high robustness is an indispensible requisite in various applications of them for the efficient clinical uses. Although recently a growing number of reports demonstrate that topography or geometry of the substrate also plays an important role in the fate of the stem cells, most of these studies are usually conducted by a few distinct patterns such as simple lines, posts or other specified shapes. As a result, there is a lack of quantitative and comprehensive analysis of the relationship between topographical variation and the differentiation of stem cells. In this study, I systematically examined the effectiveness of topography variation on osteogenic differentiation with several micropatterned substrates after designing a series of lattice micropatterns. For this study, I used seven kinds of micropatterns ranging from flat to 8 μm (flat, 1, 2, 3, 4, 6, 8 μm) in the interval length, with 1 μm height in all micropatterns. I examined the expressions of the osteogenic markers, alkaline phosphatase, collagen type-I and osteocalcin in murine mesenchymal stem cells cultured on the prepared lattice micropatterns. The results show that the effectiveness of the osteogenic differentiation has a peak value on the 3 μm interval length. This demonstrates that the differentiation of stem cells can be controlled by not only chemical factors but also topographical factors of substrates. Additionally, I empirically observed that the focal adhesions maturation were highly dependent on the topography of the substrate although the shapes, morphology and spreading of cells on different substrates do not have meaningful difference. Based on this empirical observation, I furthered my study for in-depth understanding the underlying pathway of topographical cue on the stem cell differentiation by first examining the focal adhesion and actin cytoskeleton property. On this perspective, first I compared the formation of focal adhesions of cells cultured on the different substrates; flat one (without topography) and micropattern (2 μm lattice pattern with 3 μm interval length and 1 μm depth). I demonstrate that not only the focal adhesion, actin polymerization is also strongly developed at the cells cultured on the micropattern. These different cell behaviors let me focus the RhoA protein, one of small GTPase family and subsequent pathway since a couple of reports have demonstrated RhoA-activated cells have the enhanced focal adhesions and actin activity (polymerization) at the same time. Based on the cell behaviors regarding focal adhesion and actin activation and related previous literatures, I made a hypothesis about the cellular steps on the topography-mediated focal adhesion formation and actin activation as follows: 1) initial cell adhesion and topography sensing step via integrins since previous studies reported integrins, especially β1, act as a mechanosensor to probe the surrounding, 2) cell spreading, 3) topography-dependent activation of RhoA-ROCK pathway and 4) myosinII stimulation 5) actin activation (substrate contraction) through myosin II and guided and enhanced focal adhesion formation. By inhibiting the Rho-related kinase (ROCK) and subsequent myosin light chain kinase (MLCK), I found that the focal adhesion formation is highly decreased by those inhibitions. Not only so, the topography-dependency of focal adhesion formation is highly decreased. These suggest that RhoA pathway is critical for the formation of the focal adhesion. Moreover, at the cells on the micropatterns, the integrin α5 is highly expressed and focal adhesion kinase is also more activated (pY397). This result demonstrates that activation of integrin α5 and phosphorylation of FAK are accompanied with the maturation of focal adhesion and myosin II-generated cytoskeletal contraction. Through my studies (topographical effect on stem cell differentiation and then focal adhesion maturation including actin cytoskeleton activation), I could speculate the topographical effect on the stem cell function (esp., differentiation) as follows. First, the topography-mediated enhancement of focal adhesion and actin cytoskeleton polymerization may strongly influence the differentiation of the stem cells. The rational behind this speculation is that a couple of previous reports have also shown that RhoA activation (by chemical and physical cues) enhances the specific differentiation efficiency of stem cells. Therefore I could rationalize that the appropriately well-designed topography of the substrate upregulate the activation of RhoA pathway which then results in the subsequent enhancement of focal adhesion, actin polymerization and the differentiation of stem cells.

本論文は,材料の格子状のマイクロパターンが,マウスの間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化に及ぼす効果に関するものである.再生医療においては,幹細胞を如何に目的の細胞に分化させるかは重要な課題であり,それらの研究は主に生化学的な因子を用いて研究されてきた.一方,生化学的因子による細胞の分化制御にかかるコストは,その細胞数にリニアに比例する.ところが再生医療においては,医学の基礎実験とは異なり分化させるべき細胞数は10の7乗から8乗になることが一般的である.この場合,生化学的因子を用いた分化制御にかかるコストは,臨床的には非現実的なものとなる.この点が,再生医療の実現化を大きく阻んでいる障壁の一つである.本論文は,その障壁をマテリアルという異なる角度から乗り越えようとするもので,マテリアルを用いることによるコストは細胞数に直ちには比例しないため,もしマテリアルによる分化制御が実現すれば,再生医療の実現化に大きく寄与するものと考えられる.本論文のこのような研究のモーチべーションについては,審査委員会において大きく評価された.

マテリアルによる細胞の分化制御の手法については,類似研究においてはスティッフネスなど,主に材料の機械的な性質に着目して研究が進めてられてきた.事実,幹細胞をスティッフネスの異なる材料上で培養することで,様々な細胞種に分化させることが可能であるとする研究結果が報告されている.一方,本論文のオリジナリティは,分化制御させるパラメータとして材料表面の凹凸,特に格子状のパターンを用いた点にある.格子パターンにおいては,それを網羅的に作製しようとすると格子の幅,間隔,高さなど変数が多く有り,非現実的である.本論文においては,細胞の大きさを基準にとり,格子に接着して成育する細胞にとって影響を及ぼすと考えられる格子の間隔,幅を想定し,また高さについては固定した.この点は,現実的な実験計画が立案されていると評価された.

格子状のパターンで幹細胞を培養し,分化制御の評価としてはリアルタムRT-PCRを用いて,骨芽細胞において発現している典型的な遺伝子について定量している.格子の間隔を変化させた場合,骨芽細胞のマーカ遺伝子の発現に一定のピークを持ったパターンが表れることを示した.このピークをもった発現パターンは,骨芽細胞に分化させるのに適した格子パターンが存在することを示しており,本論文の主要な成果であると評価された.

また,抗体免疫染色法を用いて細胞内骨格であるアクチンと,細胞接着斑を構成する分子であるビンキュリン等を蛍光染色し,格子パターンの違いによる細胞の接着および細胞骨格の発達,細胞接着斑の形成位置などについて定性的な評価を行った.さらに,アクチンの形成を促進するミオシンを阻害する因子など阻害因子を添加することが,格子パターンの違いによる効果に影響を及ぼすかどうか検証している.これらは全て,何故,格子パターンの違いが,幹細胞の骨芽細胞分化に影響を及ぼしているかについて,そのメカニズムを考察しようとするためのものである.このように,格子パターンの違いが,幹細胞の骨芽細胞分化に影響を及ぼす,という事実を見出しただけでなく,そのメカニズムにも迫ろうとしたもので,その考察内容は評価された.ただし,メカニズムについては決定的に解明した訳では無く,状況証拠を積み重ねたものである.この点については,本研究がさらに発展性を持って,引き続き探究されるべきものであると審査において認識された.

以上要するに,格子パターンの違いが幹細胞の骨芽細胞分化に影響を及ぼすという事実を見出したこと,何故そのような効果を持つかについて,分子レベルで状況証拠を積み重ねて一定の結論に達したこと,そしてこれらの知見がバイオエンジニアリングの進展に寄与すること,これらの事由によって本論文が博士論文として相応しいものであるとの結論に至った.

よって本論文は博士(工学)の学位請求論文として合格と認められる.