The importance of long non-coding RNAs (lncRNA) in controlling various cellular processes has been proven repeatedly over the past decade. Previous research in our lab has uncovered the existence of a novel type of sense RNA polymerase II-dependant lncRNA which reads through the fructose-1,6-bisphosphatase (fbp1+) gene, the transcription of which is essential for chromatin remodeling and full induction of fbp1+ mRNA during glucose starvation in Schizosaccharyces pombe (Hirota et al. 2008). In this study, we redefine these new lncRNAs as 'metabolic stress-induced long non-coding RNAs' (mlonRNA). Strand-specific RNA sequencing also revealed the presence of a non-coding antisense RNA which overlaps the entire fbp1+ region and promptly disappears upon glucose starvation (Arisa Oda, unpublished results). This study aims to elucidate the respective characteristics of fbp1+ antisense lncRNA (as-lncRNA) and sense mlonRNA before and during glucose starvation and the mechanisms involved in the regulation of their stability.

I have found that mlonRNA and as-lncRNA are much less stable than fbp1+ mRNA. Furthermore, all of these transcripts are 5'-capped and sensitive to the nuclear exosome cofactor Rrp6-mediated 3' to 5' degradation. This degradation did not appear to require the TRAMP complex (Trf4/Air2/Mtr4p Polyadenylation complex), as demonstrated by the lack of effect in a cid14Δ mutant. Intriguingly, disruption of the core exosome by a cold-sensitive mutation resulted in the complete loss of the starvation-specificity of the induction, as fbp1+ mRNA was fully induced even in glucose-rich media. The kinetics of fbp1+ as-lncRNA remained however comparable to the wild-type. The core exosome is therefore expected to play a more complex role in the starvation response.

Because sense mlonRNA and as-lncRNA overlap the same genomic region, it is reasonable to expect that they may form stretches of double-stranded RNA (dsRNA), which may be targeted by Dicer and enter the siRNA pathway. Moreover, RNA secondary structure prediction software revealed a strong hairpin structure in the 5' region of mlonRNA transcripts (a) and (b). mlonRNA transcript (b) in particular seemed very slightly stabilized in a Dicer deletion mutant. However, the deletion of part or whole of the potential structure had no major effect on the stability of this transcript. Since fbp1+ mlonRNA and mRNA induction proceeded fairly normally in a Dicer mutant, I expect that siRNA does not play a major role in glucose starvation at this locus.

Although mlonRNA and as-lncRNA are degraded in the nucleus to some extent, polysome fractionation results show that the majority of them are exported and bound by multiple ribosomes. Moreover, as-lncRNA and mlonRNA are differentially regulated in the cytoplasm. Both of these RNA species harbor an unusual number of small open reading frames (ORFs) compared to the average S. pombe mRNA 5' untranslated region (UTR), meaning that they could be targets of the Upf1-mediated nonsense-mediated decay (NMD) pathway. Interestingly, the glucose-rich-specific as-lncRNA were sensitive to NMD, whereas the glucose starvation-specific mlonRNA were resistant. Since small ORFs in the 5' region of mlonRNA are relatively enriched in rare codons compared to the fbp1+ coding region, I hypothesize that instead of NMD, mlonRNA may be the first natural target of the no-go decay pathway (NGD), which targets transcripts on which translation is slowed down or arrested by the presence of secondary structure or rare codons.

Overall, as illustrated below, these results reveal that fbp1+ as-lncRNA, mlonRNA and mRNA, although originating from the same locus and sharing many characteristics such as a 5' cap, poly(A)-tail, ORFs, and subcellular localization, are specifically regulated by distinct RNA surveillance systems.

真核生物のゲノムDNAには、遺伝子をコードしていない非コード領域が多く存在し、そこから無数のRNA(非コードRNA、ncRNA)が合成されていることが明らかになった。これらのRNAは、以前は「ジャンク」とか「ノイズ」などと評価されていたが、近年、遺伝子発現制御などの細胞制御にきわめて重要な役割を果たすことが明らかになってきた。本論文では、単純な真核生物である分裂酵母を用いて、ncRNAの中でもmRNAに類似した長いRNA(lncRNA, long ncRNA)について、その安定制御や細胞内での局在について解析が行われた。その結果、lncRNAの動態制御の新しい側面を明らかにした。以下に本論文の構成と概要を述べる。

第1章の序論において、遺伝子発現の基本原理である「セントラルドグマ」におけるncRNAの意義やその種類、lncRNAの機能、RNAの品質保証システム、グルコース飢餓における分裂酵母のlncRNAによるフルクトース1,6-ビスリン酸ホスファターゼ遺伝子(fbp1+)の活性機構など、本研究の背景や現状が概論されている。

第2章では研究の手法、材料と方法が記載されている。

第3章の「結果」の部は、大きく2つの部に分かれている。第1部では、分裂酵母のfbp1+ lncRNA(センス鎖およびアンチセンス鎖)のダイナミクスについて、合成反応を阻害剤で停止した後のRNA分解速度を測定した結果が述べられている。その結果、これらlncRNAがmRNAに比べて比較的早く分解されることが明らかになった。次にこの分解を担当する因子を各種変異体で解析したところ、いずれのRNAも核内のエキソソームにより部分的な分解を受けること、しかしその過半がエキソソームによる分解を免れることが示された。特に、エキソソームとの関連性があるTRAMP複合体は、これらのRNAの分解にほとんど関与しないことがわかった。興味深いことに、エキソソームのコア因子の変異体では、グルコース存在下でのfbp1+遺伝子の発現抑制が解除されることが明らかになった。また、細胞質でのRNA分解系で、異常な翻訳終始シグナルによって惹起される「ナンセンス変異依存RNA分解経路」により、アンチセンス側のlncRNAのみが選択的に分解されることを示した。

第3章第2部では、このlncRNAの細胞質における局在や、「リボソーム停滞型RNA分解経路(No Go Decay)」による安定性制御の可能性が検討された。まず、このlncRNAに回文配列が存在し、リボゾームの停滞をもたらすと考えられる「ヘアピン型RNA高次構造」の形成が示唆されること、しかしその回文構造を除去してもlncRNAの安定性には影響がないことが示された。また、ヘアピン型RNAの分解に関わるダイサーにより、lncRNAが部分的に分解されることが示された。次に、これらlncRNAが5'端にキャップ構造を有すること、キャップ構造脱理因子により、部分的にlncRNAが不安定化することが示された。しかしながら、これらの分解系の関与は限定的で、fbp1+ lncRNAの安定性制御にはその他の分解経路が重要であることが示唆された。

5'キャップ構造の存在により、fbp1+ lncRNAが細胞核から細胞質に移行することが示唆されたので、次にこのlncRNAが細胞質のリボソームなど翻訳装置に結合するか、ポリソーム分画法による検証が行われた。その結果、fbp1+ lncRNAは確かに翻訳装置に取り込まれることが示された。また、バイオインフォマティクス手法により、fbp1+ lncRNAには通常のRNAに比べて例外的にレアコドン(稀に使われるコドン)が多いことが示された。多数のレアコドンの存在により、lncRNA上でリボソームが停滞し、リボソーム停滞型RNA分解経路が作動し、分解に至る可能性がはじめて示唆された。

考察では、互いによく似たfbp1+ lncRNA(センス鎖とアンチセンス鎖)およびmRNAの安定性が、異なるRNA品質保証経路で制御されている可能性が議論された。また、遺伝子発現制御に関わるlncRNAが、細胞質に移送され、翻訳と共役して分解される仕組みについて提案がなされた。

本研究により、昨今注目されているlncRNAの安定性に関するはじめての系統的な解析であり、lncRNA分解に翻訳共役型RNA品質保証系の関与を示した点で、当該分野に大きな貢献を行ったと考えられる。特に、リボソーム停滞型RNA分解経路の天然の標的RNAはこれまで同定されておらず、今回の解析でlncRNAがその有力な標的であることがはじめて示唆された点は、今後の研究の方向性を示唆した点で意義深い。

なお、本論文のデータは、小田有沙、三木敦子、稲田利文、および太田邦史との共同研究により得られたものである。しかし、論文提出者が主体となって分析及び検証を行ったもので、論文提出者の寄与が十分であると判断する。したがって、審査委員会は全員一致でGalipon Josephine Francoiseに博士(理学)の学位を授与できると判断する。