Circadian rhythms with a period of approximately 24 hr are generated by an internal timekeeping mechanism referred to as the circadian clock. The mammalian circadian clocks are driven by a transcription-translation-based negative feedback loop. Among the clock proteins, CRY1 and CRY2 act as key players through their strong repressive activities on the E-box-mediated transcription. The previous study reported that CRY2 is phosphorylated at Ser557 in a circadian manner in the mouse SCN and liver. The priming phosphorylation of CRY2 at Ser557 allows subsequent phosphorylation at Ser553, and the two-step phosphorylation of CRY2 leads to its proteasomal degradation. On the other hand, FBXL3, an F-box-type E3 ubiquitin ligase, ubiquitinates CRYs and mediates their degradation. Two point mutations in mouse Fbxl3, i.e., After-hour (Afh) and Overtime (Ovtm), each causes remarkable lengthening of the free-running period of the mouse behavioral rhythms. In the present study, 1) I investigated the physiological role of Ser557 phosphorylation of CRY2 by using mutant mice carrying a mutation at Ser557. Furthermore, 2) I focused on FBXL21, a homologous protein of FBXL3, and examined its regulatory mechanism of CRY stability and the circadian clock. These analyses revealed a complex network of CRY regulation by posttranslational modification and their critical role in the circadian clock.

1). S557A-CRY2 knock-in mice exhibited significantly longer circadian periods of wheel-running activity rhythm as compared to the wild-type mice. In the mutant mice liver, CRY2 protein levels were abnormally increased, resulting in downregulation of E-box-mediated transcription. Collectively, I concluded that Ser557 phosphorylation-dependent degradation of CRY2 inhibited the abnormal accumulation of CRY2 proteins and is required for maintaining circadian periods in both the central and peripheral clocks.

2). I found that FBXL21-catalyzed ubiquitination stabilized CRY proteins and antagonized FBXL3-mediated destabilization by conjugating different type of ubiquitin chains. Fbxl21-null mice exhibited normal periodicity of behavioral rhythms with compromised organization of daily activities, while an extremely long period of Fbxl3 null mice was compensated in Fbxl3/Fbxl21 double-knockout mice. The double knockout destabilized the behavioral rhythms progressively in constant darkness and sometimes elicited arrhythmicity. These results emphasize the physiological importance of antagonizing actions between FBXL21 and FBXL3 on CRYs, and their combined actions at different subcellular locations provide stable oscillation of the circadian clock.

本論文は全四章で構成されており、第一章は全体の研究背景である。ほ乳類の概日時計の背景知識として、(1)概日時計の発振を担う転写・翻訳を介したネガティブフィードバックモデル、(2)時計タンパク質の中枢因子CRYタンパク質について概説している。当該分野においては『CRYタンパク質がどのように合成され、どのように減少するか』というCRYのタンパク質ダイナミクスを生み出す分子機構の解明が重要な研究課題である。

第二章は、CRY2のリン酸化部位の変異マウスを用いた研究結果がまとめられており、研究の背景、実験手法、実験結果、考察の四項目から成る。背景では、概日時計における時計タンパク質のリン酸化シグナルの重要性が例示されている。マウスCRY2はC末端の2つの近接したセリン残基が段階的にリン酸化され、分解制御を受ける。しかし、この分解機構の概日時計における生理的意義は未解明であった。そこで論文提出者は、CRY2の一次リン酸化部位Ser557に変異を導入したマウスを作製し、CRY2分解が果たす役割の解明を目指した。マウスの輪回し行動解析により、変異マウスでは野生型マウスに比べて長周期の行動リズムを示すことを明らかにした。肝臓における時計因子の発現リズムを解析したところ、変異マウスにおいてはCRY2とPER2タンパク質が核で過剰に蓄積していた。一方、CRY2-PER2複合体のターゲット遺伝子のmRNAの発現量が減少していた。これらの結果から、CRY2のリン酸化に依存した分解制御はCRY2の過剰な蓄積を抑制し、時計遺伝子の発現と概日時計の周期を調節すると結論した。考察では、本研究で得られた実験結果とキナーゼの機能阻害の実験結果と比べて議論し、タンパク質の修飾部位の変異マウスを作製することの有用性と、実験結果の正確性が述べられている。

第三章は、FBXL21によるCRY1とCRY2安定性の制御機構とその生理的役割についての研究成果がまとめられている。CRYはF-boxタンパク質FBXL3による分解制御を受け、Fbxl3の点変異マウスは長周期の行動リズムを示す。しかし、FBXL3と最も近縁なF-boxタンパク質であるFBXL21の概日時計における役割はまったく不明であった。論文提出者は、Fbxl3とFbxl21欠損マウスを使用し、行動リズム制御におけるFbxl21の役割を調べた。その結果、Fbxl3欠損マウスの異常な長周期性がFbxl21の欠損により大きく緩和された。さらに、Fbxl3/Fbxl21二重欠損マウスの一部は、恒暗条件において行動リズムが消失した。興味深いことに、FBXL21はCRYをユビキチン化してCRYの安定化に寄与することが明らかとなった。これらの結果を受け、考察ではFBXL3によるCRYの分解とFBXL21によるCRYの安定化機構は、CRYタンパク質量のダイナミクスを生み出し、概日時計の安定な振動の維持に必須であると結論した。

第四章は総括が述べられている。本研究により、時計の中枢因子CRYがいかに複雑な翻訳後修飾ネットワークに制御されているかが明らかになった。近年、CRYはグルココルチコイド受容体やGタンパク質と相互作用して代謝に関わるシグナルを負に制御することが報告された。ユビキチン化修飾によるCRYタンパク質量の厳密な制御は、概日時計の発振だけではなく、代謝制御にも極めて重要であることを示す。論文提出者は、ユビキチン化によるCRYの制御ネットワークをCRYのユビキチンコードと称している。今後は脱ユビキチン化酵素によるユビキチン修飾のスウィッチングを含めた、CRYユビキチンコードの解明が課題であると結論づけている。

なお、本論文の第二章で得られた研究成果は、倉林 伸博、塩井 剛、深田 吉孝との共同研究による。また、本論文の第三章は、弓本 佳苗、恒松 良佑、松本 雅記、尾山 大明、秦 裕子、中川 智貴、ダーリン ランジャコーンシリパン、中山 敬一、深田 吉孝との共同研究によるが、いずれも論文提出者が主体となって研究計画を考案し、分析および検証を行ったもので論文提出者の寄与が十分と判断する。

審査時点での本論文は、略語や専門用語に関する説明が乏しかった。さらに、CRY2のリン酸化部位の変異が、CRY2のタンパク質の安定性だけでなく、転写抑制活性や、他の時計タンパク質との相互作用に影響を与えるか否かの記述がなく、本論文の結論に至るには適切ではないと判断したため、本文の改変を要求した。改変後の論文では、それらについて正確な記述とデータが追加されており、審査委員は全員一致で合格と判断した。したがって審査委員会は、論文提出者に博士(理学)の学位を授与できると認める。