In inter/intra cellular spaces with 10-100 nm size e.g., synapse and cellular tubes, molecular transport plays significant role in cell-cell communication and other interactions, which are critical for neuron activities and immune functions. Previous in vivo studies has speculatively suggested specific fluid property like higher viscosity and is dominant in the molecular transport. However, further understanding is difficult due to lack of experimental tools because of space sizes.

On the other hand, our group has recently focused on 10-1000 nm space, i.e., extended-nanospace, and revealed various specific liquid properties. From the results, we suggested the presence of a proton transfer phase of loosely coupled water molecules by hydrogen bonding in the vicinity of the wall within 50 nm, which is much thicker than well-known adsorbed water layer of several-molecules thickness. The size of extended space is similar to inter/intra cellular space. In addition, it is suggested that there are similar liquid properties between the extended-nano space and inter/intra cellular space.

Therefore, we are inspired to study molecular transport in bio-mimetic extended nanospace which has similar size to inter/intra cellular space. To realize this, firstly bio-mimetic extended nanospace modified by lipid bilayer with accurately controlled space size should be created. Furthermore, there is no method to explore the fluidic property in extended nanochannel.

The study is divided into three parts, (1) development of measurement method of fluid viscosity in nanospace. (2) construction of bio-mimetic extended nanospace and evaluation of fluid viscosity in bio-mimetic extended nanospace and (3) investigation of molecular transport in bio-mimetic extended nanospace.

(1) Development of measurement method of fluid viscosity in nanospace.

Previous work of our group revealed various specific liquid properties in fused silica nanochannel, and we proposed the presence of the proton transfer phase published in Angew. Chem. 2007, 119, 1199-1202. For the fluidic property, spontaneous capillary filling into a nanochannel showed a specific viscosity. However, since spontaneous capillary filling depends on both fluidic and interfacial properties, accurate property could not be obtained. Hence precise understanding is still insufficient even in fused-silica extended nanospace.

This study successfully developed a method to simultaneously measure the fluid viscosity and interfacial property in nanospace by controlling meniscus motion using an MPa order external pressure. By using the method, the water viscosity and wetting property in fused silica nanochannels were measured for various sizes and confinement dimension for the first time.

Results showed that water viscosity increases with deceasing the channel size, especially for square nanochannel (nanoscale width and depth by two dimensional nanoconfinement), compared with plate nanochannel (microscale width and nanoscale depth by one dimensional nanoconfinement), while the wetting property was almost constant. These results suggest specificity of liquid two dimensionally confined in extended nanospace, which has high viscosity by a viscous boundary water phase of similar scale to the proton transfer phase.

(2) Construction of bio-mimetic extended nanospace and evaluation of fluid viscosity in bio-mimetic extended nanospace.

In inter/intra cellular space, specific fluidic property like higher viscosity was suggested. However, further investigation is difficult due to space size.

Here, bio-mimetic extended nanospace was successfully developed by lipid bilayer modified to fused-silica extended nanochannel with vesicle fusion method. The principle is that sphere vesicles in aqueous rupture and form lipid bilayer by interacting with glass substrate. In this in vitro approach, space size and materials can be accurately controlled. The thickness of lipid bilayer was evaluated by fluidic AFM and modification result was validated by XPS analysis.

Afterwards, fluidic property in bio-mimetic extended nanospace was investigated. An increase of viscosity in bio-mimetic extended nanospace, which has similar tendency to fused silica nanospace, was revealed for the first time. This result suggests that contribution of the near-field liquid structure to the fluidic property is also significant in inter/intra cellular spaces. The lipid bilayer has a strong interaction with the water molecules by hydration, while the ions included in the bio space may reduce the interaction by ion hydration. This study suggests that the fluidic property in the bio space will be determined by effects of cellular space size and geometry, and liquid components.

(3) Investigation of molecular transport in bio-mimetic extended nanospace.

Molecular transport in inter/intra cellular space is very important for cell-cell communication and cellular function. It is very difficult for in vivo work to exclude the effect of cells and macromolecules, therefore exploration of molecular transport by fluidic property is complicated.In this part, we measured the diffusion coefficient of Green Fluorescent Protein (GFP) in artificial biological solution in bio-mimetic nanospace. The result suggests that the diffusion coefficient of GFP decreased in bio-mimetic extended nanospace. In addition, the decreased diffusion coefficient is consistent with increased viscosity, which indicates that the specific molecular transport is induced by unique fluid viscosity.

Conclusively, measurement method of fluidic property in nanosapce was successfully developed, and fluidic property in bio-mimetic extended nanospace was revealed for the first time, finally specific molecular transport was clarified in bio-mimetic extended nanospace. This work will not only provide a general model of the cellular functions derived from inter/intra cellular spaces based on the microscopic liquid model, but also propose a new concept of importance of morphology of 10-100 nm inter/intracellular space, which have not been understood in conventional biology.

本論文は10-1000 nmの細胞間・細胞内空間を模擬したバイオミメティック拡張ナノ空間の分子輸送に関する研究をまとめたものである。以下、10-1000nmを拡張ナノと称する。神経系シナプス間隙やミトコンドリアといった拡張ナノオーダの細胞間・細胞内空間での分子輸送は、生体機能を決定付ける支配的因子の一つである。近年の研究から、この空間における輸送現象の特異性が示唆されてきた。しかし、空間サイズが極微小なためin vivo研究での解明は困難であり、有効な実験ツールもなかった。一方、本学位申請者が所属する研究室ではガラス基板への拡張ナノ流路の加工法とそこでの流体制御法を確立してきた。これらを用いて拡張ナノ空間に閉じ込めた水の特異性を明らかにして、ガラス表面から約50 nmの領域に水分子が緩やかに構造化したプロトン移動相が介在する三相モデルを提案するに至った。そこで本研究では、細胞間・細胞内拡張ナノ空間においても特異的な水の構造による流体特性が発現していると推測し、これまでにないin vitro実験ツールとして生体環境を模擬したバイオミメティック拡張ナノ空間を創成して、この実験空間を活用して分子輸送を明らかにすることを着想した。以上より、本学位請求論文は次の構成とした。

第1章 本研究の背景と目的

第2章 細胞間・細胞内空間分子輸送の解明のためのin vitroツールの創成

第3章 バイオミメティック拡張ナノ空間における流体特性と表面物性の解明

第4章 バイオミメティック拡張ナノ空間形状による流体特性への影響

第5章 バイオミメティック拡張ナノ空間における分子輸送の解明

第6章 まとめ・今後の展開

以下、各章について簡単に説明する。

第1章では、細胞間・細胞内拡張ナノ空間の研究の現状など、本研究の背景をまとめた。従来のin vivo研究の問題点を整理して、新しいin vitro手法を提案するとともに、分子輸送を解明するための課題として(1)バイオミメティック拡張ナノ空間の創成、(2)拡張ナノ空間の流体特性と表面物性の測定法の開発、(3)三相モデルにもとづいた空間サイズ制御による実験的研究を挙げ、本研究の意義を明確にして、その目的を明らかにした。

第2章では、バイオミメティック拡張ナノ空間を創成し、更に拡張ナノ空間の流体特性と表面物性の測定法を開発した。細胞環境を再現するためにガラス基板に加工した拡張ナノ流路へのリン脂質二重膜修飾を着想した。ベシクルを拡張ナノ流路に導入してガラス表面に展開させることでバイオミメティック拡張ナノ空間をはじめて実現し、空間サイズや形状も自在に制御可能であることを示した。一方、毛管現象を用いて拡張ナノ空間の溶液物性測定法も開発した。圧力駆動により毛管現象を制御し、リン脂質二重膜修飾された疎水性流路での測定などをはじめて実現した。これらの手法は、生物物理化学や薬学の研究にin vitro手法を提供し、また近年発展の著しいナノ流体工学の基礎学理の確立にも大きく貢献すると期待される。

第3章では、バイオミメティック拡張ナノ空間での流体特性と表面物性の関係などを明らかにした。様々なサイズでの測定の結果、バイオミメティック拡張ナノ空間では1000 nm以下で水の粘度が上昇することをはじめて明らかにした。ガラス流路における測定結果との比較から、このような特異性はリン脂質二重膜のリン酸基により、ガラス表面のシラノール基と同様50 nm程度にプロトン移動相が形成することによると示唆された。

第4章では、バイオミメティック拡張ナノ空間の形状の効果について検討した。流路の幅と深さが同じスクエア型と、幅が深さより十分大きいプレート型のバイオミメティック拡張ナノ空間における測定結果を比較した。その結果、拡張ナノ空間における特異な流体特性は水を二次元的に拡張ナノスケールで閉じ込めたスクエア型でのみ発現し、プレート型の一次元的な閉じ込めでは発現しないことをはじめて明らかにした。なお、この成果は当初予想していない実験から得られた。

第5章では、バイオミメティック拡張ナノ空間における分子輸送を解明するために緑色蛍光タンパク質の拡散定数を測定した。その結果、拡張ナノ空間領域では拡散定数が低下することをはじめて見出した。また、拡散定数の低下は第3章で明らかにした粘度の上昇と対応しており、特異的な流体特性によるものであることを明らかにした。

第6章では本研究の学術上の意義をまとめた。細胞間・細胞内空間を模擬するバイオミメティック拡張ナノ空間を創成して、従来になかった新しいin vitroツールを実現した。これを用いることで、細胞間・細胞内拡張ナノ空間のサイズと形状により特異な水の構造が顕在化して粘度が上昇し、分子拡散速度が低下することをはじめて実証した。これは、生体システムでも拡張ナノスケールの空間ではその大きさと形態により水の物性が通常とは異なり、その特異性のもとで生命現象が発現していることをはじめて実験的に示唆した極めて重要な知見であり、今後の生物物理化学や流体科学への貢献が期待される。

以上、生物物理化学や薬学の分野に新しいツールを創成して、それにより細胞間・細胞内拡張ナノ空間の分子輸送を解明し、生体機能を理解する上で重要な知見を呈した本論文はバイオエンジニアリングに貢献するものであり、博士(工学)の学位請求論文として合格と認められる。