Cancer became one of the top threats to people's health causing high death rate in Japan and all over the world. Early detection of neoplastic lesions is critical for success in cancer treatment and recovery health. Several cancer diagnostic imaging methods such as X-ray, computed tomography (CT), magnetic resonance image (MRI), ultrasound and position emission tomography (PET) are widely used in clinical. Including, magnetic resonance imaging (MRI) provides a powerful diagnostic imaging modality of cancer, because of its non-invasiveness, high definition and precise three-dimensional position ability. Several kinds of contrast agents are used in clinical to enhance the signal of MR images, such as T1 type contrast agents like Mn(II)-based agents and Gadolinium (III)-based agents which make the enhanced parts became white, and T2 type contrast agents like iron oxide materials which make the enhanced parts black. But those commercial used contrast agents are small molecules has short blood circulation time and spreading systemically in the body, which could increase the signal of background tissues to make tumor detection become a challenge.

Nanodevices have been recently developed to selectively deliver imaging agents to solid tumors by passively leaking out from circulation and accumulate in the tumor positions due to the enhanced permeability and retention effect (EPR effects). Among promising nanodevice systems for MRI, block copolymeric micelles, i.e. nanostructures consisting of a drug-loaded core and poly(ethylene glycol) (PEG) protective shell, present exceptional advantages including their relatively small sizes, ability to engineer drug loading mechanisms, controlled release of their cargo, prolonged life in the bloodstream and enhanced accumulation in solid tumors after intravenous administration. Therefore, this research aimed to develop a series of novel T1 contrast agent loaded nanocarriers, which could target cancer and cancer metastasis and enhance the contrast of magnetic resonance imaging (MRI) for precise diagnosis.

Firstly, Nanodevices for Magnetic Resonance Imaging of cancer were self-assembled to core-shell micellar structures by metal chelation of Gd-DTPA, a clinical widely used T1-contrast agent, to poly(ethylene glycol)-b-poly(N-{N'-(2-aminoethyl) -2-aminoethylaspartamide) copolymer via Pt(IV) in aqueous solution. Gd-DTPA-loaded polymeric micelles (Gd-DTPA/m) showed a hydrodyamic diameter of 45 nm and a core size of 22 nm. Confining Gd-DTPA inside the core of the micelles increased the relavity of Gd-DTPA more than 13 times (45 mM-1s-1). Moreover, in physiological conditions, the ligand exchange reaction of Pt(IV) from the carboxylic group of Gd-DTPA to chloride ions results in sustained release of free Gd-DTPA, which can be rapidly excreted from the body. The improved tumor accumulation of Gd-DTPA loaded micelles (Gd-DTPA/m) enhanced the T1 weighed contrast of the malignancies in mice. On the contrary, free Gd-DTPA could not enhance the signal in tumor position. μ-synchrotron radiation-X-ray fluorescence results confirmed that Gd-DTPA was delivered to the tumor sites by micelles.

Calcium phosphate is a non-toxic and biocompatible materials demonstrating its widly application as biomaterials in tissue engineering and drug delivery system. Here, PEGlyated calcium phosphate hybrid nanoparticles incorporating Gd-DTPA with enhance relaxivity for MRI has been developed by hydrothermal synthesis method. This Gd-DTPA loaded CaP nanoparticles (Gd-DTPACaP) have a diameter of 75 nm and a ξ-potential of -0.3 ~ -0.7 mV. The relaxivity of Gd-DTPACaP was increased 6 times (18 mM-1s-1) higher than free Gd-DTPA. Moreover, non-cytotoxicity was investigated from MTT assay both on C-26 tumor cell lines and HUVEC normal cell lines after 72 hours incubation. In vivo, Gd-DTPACaP has longer circulation time in plasma and passively accumulated in tumor position by EPR effects leading to contrast enhancement about 40% in tumors position according to MRI measurements. Finally, the tumor position was sliced and scanned by μ-Synchrotron radiation-X-ray fluorescence in SPring-8 conforming lots of Gd-DTPA was delivered to tumor position.

Mn2+ is another T1-contrast agent of MRI as it could conjugate with some protein as albumin to increase the relaxivity, but its toxicity limited further application. Therefore, we prepared MnCaP nanoparticles with crystal core of MnCaP and PEGylated surface. The MnCaP nanoparticles has a diameter of 80 nm and a ξ-potential of -2 ~ -5 mV. MnCaP showed reduced toxicity from in vitro cytotoxicity test on HUVEC normal cell lines and C-26 tumor cell lines, and in vivo toxicity test on nude mice. The LD50 of MnCaP was enhanced 5 times higher than MnCl2 of 0.22 mmol/kg. MnCaP is pH responsive, stable at pH 7.4 of physiological condition and brake at pH lower than 6.7 releasing Mn2+, which could bonding albumin to increase the relaxivity. MnCaP nanoparticles was intravenous injected to C-26 subcutaneous tumor bearing Balb/c nude mice at a dose of 0.22 mmol/kg, then take the MR images every 30 min using 1 T MRI machine. Gd-DTPA was used as control sample for MRI measurement with the same dose. Cancer could be fast detected on the mice administrated with MnCaP and there was no signal enhancement of injection Gd-DTPA. Moreover, MnCaP also showed a higher contrast enhancement than MnCl2 at a dose of 0.045mmol/kg, because the LD50 of MnCl2 is 0.22 mmol/kg. Moreover, liver metastasis tumor model was made on Balb/c nude mice by implant C-26 tumor cells to into mesenteric vein. Then, 9 days later, the liver metastasis position was diagnosed by MRI administration of MnCaP to liver metastasis bearing mice at a dose of 0.22 mmol/kg. Even quite small liver metastasis could be detected by MRI with the contrast of MnCaP.

Those T1-contrast agent loaded nanoparticles exhibited low toxic, high stability, increased relaxivity, extended plasma circulation time and f high ability for MR cancer imaging. Those nano-scaled contrast agents may be further applied in clinical for cancer and cancer metastasis diagnosis, which could give cancer incidents effective and in time therapy. This study also provides a novel and facile strategy for incorporating contrast agents, dyes and bioactive molecules into nanodevices for developing safe and efficient drug carriers for further clinical applications.

がんは、国民の2人に1人が罹患、3人に1人が死亡する国民病となっており、画期的な診断・治療法の開発が望まれている。がんの診断においてはPETやMRI等のイメージング技術が急速な進歩を遂げ、早期発見や精密診断に貢献している。このなかで、MRIは世界で最も急速に普及している画像診断技術であり、被爆等の問題がなく、軟部組織の質的変化も可視化できることから近年その重要度がとみに高まっている。しかしながら、その精度向上のためにはがん組織を選択的に描出できるMRI造影剤の開発が大きな課題となっている。リポソームや高分子ミセル等のナノキャリアを利用することによって抗がん剤等の薬剤をがん選択的に集積させる薬剤送達システム(DDS)は、効果に優れ、副作用の少ない画期的な治療法を実現するための有効なアプローチとして大きな注目を集めている。一般的に、がん組織では、血管壁の透過性が亢進し、リンパ系が未発達であるために、高分子物質が集積し、滞留しやすい環境が形成されており [Enhanced Permeability and Retention(EPR)効果]、リポソームや高分子ミセルなどのナノキャリアをがん組織選択的に集積させることができる。従って、これらのナノキャリアにMRI造影剤である酸化鉄微粒子やガドリニウム錯体を搭載し、がんの精密診断へと展開する研究が活発に行なわれている。本論文では、T1造影剤として広く使われているGd錯体(マグネビスト、 Gd-DTPA)とマンガンイオンを固形がんに選択的に送達するナノキャリアとして、ブロック共重合体の自己会合によって形成される高分子ミセルに着目し、高い安全性と固形がん選択的なMRI信号強度の増大を実現しうる新規ナノMRI造影剤の開発を行っている。以下に、各章ごとに対する審査結果の概要を述べる。

第一章の序論では、がんに関連した基本的な知識と診断・治療の必要性および現状に関してまとめている。がんの診断法に関しては、MRI、CT、超音波、PET、SPECT、蛍光などの各診断法の特徴に加えて利点と欠点を述べ、MRIの重要性について述べている。MRIに関しては、T1造影剤とT2造影剤の基本原理に加えて特徴や適用について述べ、現在使用されている造影剤をまとめている。最後に、ナノキャリアを用いたがん診断・治療技術の背景と最近の動向についてまとめ、基本的なナノキャリア設計や可能性について述べた後に、本研究の意義を説明している。

第二章では、側鎖に白金(IV)イオンのキレート化剤となるエチレンジアミン構造を有し、生分解性を示すpoly(ethylene glycol)-poly{N-[N'-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl]aspartamide} [PEG-PAsp(DET)]、ヘキサクロロ塩化白金酸、Gd-DTPAの水中における錯体形成反応を利用することによって、Gd-DTPAを内包した粒径40-50nmの高分子ミセルを開発することに成功している。調製したGd-DTPA内包ミセルは、パルスNMRを用いた評価によってフリーのGd-DTPAの13倍の緩和能を有することを示し、さらに生理食塩水中においてGd-DTPAのカルボキシル基と白金原子の配位子交換反応によってGd-DTPAを徐放することが明らかにした。Gd錯体は体内への蓄積毒性が問題であり、Gd錯体を共有結合でキャリア担体に結合したプローブでは安全性が大きな問題となるが、本システムでは、可逆的な錯体形成の利用によってGd-DTPAを放出させることに成功しており、安全性面において高い優位性を有するものである。細胞毒性評価では、Gd-DTPA内包ミセルは低毒性であることを示し、さらにマウス大腸がん細胞の皮下移植モデルマウスを用いた動物実験において、Gd-DTPA内包ミセルの固形がんへの選択的かつ効果的な集積と固形がんに選択的なMRI信号の増強効果を明らかにしている。

第三章では、上記の金属錯体形成を利用した系とは異なるGd-DTPAを固形がんに選択的に送達するナノキャリアとして、poly(ethylene glycol)-poly(aspartic acid) (PEG-PAsp)で表面が被覆されたリン酸カルシウム(CaP)ナノ粒子(CaPミセル)を開発している。CaPはアニオン性物質を取り込む性質を有しており、遊離のカルボキシル基を有するGd-DTPAもCaPミセルに安定に搭載できることを確認した。Gd-DTPA内包CaPミセル(GdCaP)は、金属錯体形成を利用した系と同様に、Gd-DTPAを徐放し、低い細胞毒性を示すことを確認した。また、GdCaPは、フリーのGd-DTPAを比べて6倍の緩和能を有することが示している。さらにマウス大腸がん細胞の皮下移植モデルマウスを用いた動物実験において、GdCaPは優れた血中滞留性を示し、固形がんに効果的に集積することによって固形がんに選択的なMRI信号の増強をもたらすことを明らかにしている。

第三章では、がん組織内の低pH環境において選択的にMRI信号を増強させるナノキャリアとしてマンガンイオンを搭載したCaPミセル(MnCaP)を開発している。MnCaPは、pHに応答して溶解する特性を有しており、低pH環境においてマンガンイオンを放出することが確認した。ここでマンガンイオンは、アルブミン等の血漿タンパク質との相互作用によって緩和能が10倍以上に増大する特性を有するために、MnCaPは腫瘍内の低pH環境で選択的にマンガンイオンを放出し、MRI信号強度の増大をもたらすことができるものと考えられる。そこで、マウス大腸がん細胞の皮下移植モデルマウスを用いてMnCaPのMRI造影能を評価したところ、投与後2時間までに腫瘍全体のコントラストが上昇した後に腫瘍の中心の信号強度が著しく増大することを確認した。この部分は、アシドーシスによってpHが低下している低酸素領域(Hypoxia)であると考えられ、MnCaPは治療抵抗性がん細胞が存在するHypoxiaをイメージングできるプローブになりうることが示唆されている。また、さらにMnCaPを大腸がんの微小肝転移のイメージングへと展開し、数mmの微小がんをMRIによって検出することに成功している。

第四章では、総括として本論文で開発したナノMRI造影剤の特性をまとめると共に、それらの固形がんのイメージングによる精密診断の将来展望について述べている。

以上、本論文では、高分子-金属錯体ミセルとCaPミセルという2種類の系を活用することによって、優れた血中滞留性と固形がんへの選択的集積を実現する一方で、Gd錯体やマンガンイオンを徐放することのできる新規ナノMRI造影剤を開発している。これらのシステムは、非常に高い安全性を有しており、既存のMRI造影剤では達成できない固形がん選択的なMRI信号の増強をもたらすことを明らかにした。さらに、MnCaPは、がんのHypoxiaをイメージングできる特性を有するものと考えられ、微小がんのMRIによる検出を可能にする新規プローブとして今後さらなる展開が大きく期待される。本論文に記されたこれらの高分子ミセル型MRI造影剤の基本設計はナノキャリアを利用した診断用プローブの開発において極めて有益な知見を与え、バイオエンジニアリング研究の発展に大きく貢献するものと確信する。

よって本論文は博士(工学)の学位請求論文として合格と判断される。