The hydroxy amino acids, which are components of glycopeptide antibiotics, cyclodepsipeptides and collagen, have many physiological activities. Some hydroxy amino acids can also be used as precursors in the asymmetric synthesis of pharmaceuticals. For example, (2S,3R,4S)-4-hydroxyisoleucine has insulinotropic and anti-obesity effects and seems to have potential for the treatment of diabetes.

The hydroxylation of amino acids is catalyzed by the ferrous [Fe(II)]- and α-ketoglutarate (α-KG)-dependent dioxygenases. These enzymes can also hydroxylate proteins, nucleic acids, lipids and small molecules. They participate in a vast array of protein side-chain modifications, repair of alkylated DNA/RNA, and biosynthesis of antibiotics and plant products. Dioxygenase-mediated hydroxylation requires dioxygen as well as Fe(II) and α-KG. One of the oxygen atoms is incorporated into the substrate to form hydroxy amino acid, while the other oxygen atom is used to oxidatively break down α-KG into succinate.

SadA is a member of the dioxygenase family from Burkholderia ambifaria AMMD. This enzyme is useful as a novel biocatalyst for the (R)-selective hydroxylation at the C-3 position of N-substituted L-amino acids, especially N-succinyl-L-leucine (NSLeu), to produce N-succinyl-(R)-3-hydroxy-L-leucine (NSHLeu) with >99% enantioselectivity (Fig. 1). (R)-3-hydroxy-L-leucine is a promising material for the preparation of certain cyclic depsipeptides which function as platelet aggregation inhibitors and is also a component of the antibiotic lysobictin. In addition, SadA is the first characterized Fe(II)- and α-KG-dependent dioxygenase that catalyzes N-substituted aromatic L-amino acids. Thus, SadA has the potential for widely producing C3-hydroxylated amino acids with various types of branched chain or aromatic ring. Although a few Fe(II)/α-KG-dependent dioxygenases are known to hydroxylate free amino acids, their substrate specificities are restricted to hydrophilic amino acids such as L-arginine and L-asparagine. Therefore, the mechanism for the substrate specificity of SadA remains poorly understood.

Here I report the structures of SadA.Zn(II) and SadA.Zn(II).α-KG. In addition, based on the structures and mutation analyses, I propose a substrate-binding model to elucidate the structural basis of the substrate specificity and enantioselective hydroxylation. The structural insights will be used for expanding the substrate specificities of SadA toward some derivatives of N-succinyl branched chain or aromatic amino acids by protein engineering approaches.

Overall structures of SadA complexes

The crystal structures of SadA.Zn(II) and SadA.Zn(II).α-KG were determined at 1.77 A and 1.98 A resolutions, respectively. The structure of SadA.Zn(II) contained 11 β-strands, 6 α-helices and one 310 helix, and possesses the DSBH fold at the core of the structure (Fig. 2). The DSBH fold of SadA was comprised of seven β-strands, four of which (β3, β5, β8 and β10) formed a major β-sheet and other three β-strands (β6, β7 and β9) constituted a minor β-sheet. The β1, β2, β4 and β11 strands extended the major β-sheet. Six α-helices (α1-α6) packed along the major β-sheet of DSBH fold.

SadA formed a dimer in the crystals as well as in solution. The dimeric contact area is mainly comprised of the residues of α4 and loop between α5 and β4. The dimer forms an intermolecular disulfide bond, two salt bridges, the hydrophobic interactions and intermolecular hydrogen bonds. These interactions serve as key structural features in stabilizing the dimer formation.

There is one α-KG molecule existing only in chain A (Fig. 3). The α-KG coordinates Zn(II) in a bidentate manner using its 2-oxo carbonyl and C-1 carboxylate groups, which form an octahedral coordination geometry complex. The 2-oxo oxygen of α-KG is located trans to Asp157 and the C-1 carboxylate is observed to be trans to His155 of the HXD/EXnH motif. The C-5 carboxylate forms two salt bridges with the side chains of Arg141 and Arg255, and two hydrogen bonds with the hydroxy group of Tyr143 and Thr257. A single water molecule is observed to be trans to His246 of the HXD/EXnH motif. This water would be displaced by O2 in the course of the catalytic reaction.

Structural basis of substrate recognition and specificity

I have performed cocrystallization and soaking experiments with N-oxalylglycine (NOG, an α-KG analogue) and some substrates under aerobic or anaerobic conditions, but failed to obtain the complex structure. Therefore, I attempted to build the docking model with NSLeu and NSPhe. Initially, the MOE suite was used to predict the locations of an NSLeu molecule in the active site, and I presumed the presence of several residues related to substrate-binding of SadA. The mutation analyses of the predicted residues were performed to evaluate whether the mutations affect the SadA activity toward NSLeu (Fig. 4).

The results were as follows: 1) The binding site of the N-succinyl group is located in an electropositive-rich cavity by the formation of salt bridges with the side chains of Arg83, Arg163 and Arg203; 2) The hydrophobic interactions of the side chain of N-succinyl amino acid probably are formed with the main chain of Gly79 and the phenyl ring of Phe261; 3) the hydroxy group of Thr77 is predicted to bind the carboxyl group of the substrate. The substrate-binding models were refined according to the results of mutaion analyses (Fig. 5).

Functional modification of SadA targeting industrial manufacture

Based on the structures of SadA.Zn(II).α-KG and the proposed substrate-binding model, we used structure-based protein engineering approach to improve the efficiency of catalyzing C-3 hydroxylation of novel N-succinylated amino acids (NSX) and develop an effective industrial catalyst starting from an enzyme that owned little detectable α-KG turnover activity toward NSX. Notably, I have generated SadA mutants with increased α-KG turnover activity toward NSX.

Conclusions

The crystal structures of SadA.Zn(II) and SadA.Zn(II).α-KG were determined. The residues related to substrate recognition around the active site were predicted and verified by biochemical analyses. The structural and biochemical studies revealed the structural basis of the substrate specificity and enantioselective hydroxylation. Based on the proposed substrate-binding model, I have generated SadA mutants with increased α-KG turnover activity toward the novel N-succinylated amino acids compared with that of wild type. These results will serve as a model for commercial-scale manufacture in which an enzyme is desired as the target of an industrial biocatalyst.

Fig. 1 Stereoselective hydroxylation of NSLeu into NSHLeu.

Fig. 2 Overall structure of SadA

Fig. 3 Catalytic site of SadA

Fig. 4 Relative hydroxylation activities of SadA mutants were measured toward NSLeu.

Fig. 5 Docking model of NSLeu and NSPhe into the SadA.Zn(II).α-KG structure.

本論文では、水酸化アミノ酸生産に有用なジオキシゲナーゼSadAの分子改変の基盤となる基質認識機構の解明を目的とし、X線結晶構造解析(第2章)と各種変異体酵素を用いた酵素活性の評価(第3章)を行い、SadAの立体選択性を説明する基質認識モデルを提案している。また、この基質認識モデルに基づいて基質選択性を拡大するための酵素改変を行い、その成功例について述べている。

第1章は序論として、水酸化アミノ酸及び合成方法に関するこれまでの先行研究についてまとめている。世界で承認された合成医薬品の半数以上は光学活性体(キラル化合物)である。このため、医薬品の原料・中間体としてキラル化合物の需要は極めて高く、キラル化合物の工業的な製造技術、すなわちキラルテクノロジーが注目されている。微生物由来酵素は、基質及び生成物の立体配置を認識した優れた反応特異性をもつことから、キラル化合物の効率的生産のための生体触媒として利用されている。また、これら酵素を用いたキラル化合物合成は常温・常圧条件で反応が可能であるため、有機合成と比較して環境に優しい生産手段としても注目されている。水酸化アミノ酸は3カ所の不斉中心をもち、ある特定の光学異性体だけが有用な生理活性を示すことが知られてきており、水酸化アミノ酸の医薬品としての応用が期待されている。本研究の対象であるSadAはBurkholderia ambifaria AMMD由来ジオキシゲナーゼであり、非ヘム鉄Fe(II)とα-ケトグルタル酸(第一基質、α-KG)に依存してN-スクシニル-L-ロイシン等のN修飾アミノ酸の3位水酸化反応を立体選択的に触媒する。このため、水酸化アミノ酸合成のポテンシャルをもつ酵素として有用である。

第2章では、SadAのX線結晶構造解析について述べ、構造的な特徴を論じている。申請者は大腸菌発現系を用いたSadAの発現・精製系を構築し、高純度のSadA試料を大量調製してSadAの結晶を取得した。SadAのセレノメチオニン置換体についても結晶を取得し、単波長異常分散(single-wavelength anomalous dispersion, SAD)法により、最終的にSadA.Zn(II).α-KG複合体の立体構造を1.98 Aで決定することに成功した。SadAはdouble stranded β-helix(DSBH)フォールドを持ち、2つのβシートを6つのαへリックスが取り囲む構造を形成していた。また、SadAは溶液中と結晶中で二量体として存在していることが示され、その二量体はCys101を介したジスルフィド結合、Lys171―Asp87とAsp105―Arg102の塩橋、疎水性相互作用、水素結合により形成されていた。さらに、申請者はSadAの結晶構造中には鉄イオンの代わりに亜鉛イオンが結合していることを示し、H-X-D/E-Xn-HモチーフのHis155, Asp157, His246が亜鉛イオンを三座配位で結合していること、α-KGが1-カルボキシル基及び2-オキソ基で亜鉛イオンに二座配位で結合していることを明らかにした。α-KG の5-カルボキシル基はこれまで報告されているジオキシゲナーゼとは異なる残基(Tyr143, Arg141, Arg255, Thr257)により認識されているも示している。

第3章では、基質結合に関わるアミノ酸残基の結晶構造に基づく推定と各種変異による活性への影響について述べ、基質認識の構造基盤を論じている。また、この構造基盤に基づいて基質選択性を拡大した改変酵素の取得についても示している。申請者は第二基質であるN-スクシニル-L-ロイシン等やそれらの生成物との複合体構造を取得できなかったが、SadA.Zn(II).α-KG複合体の構造に基づいてN-スクシニル-L-ロイシンとN-スクシニル-L-フェニルアラニンの結合モデルを構築し、基質の認識に重要な構造基盤の推定を試みた。MOEドッキングシミュレーションより基質の結合部位を予測し、基質結合に関わる残基としてThr77, Gly79, Arg83, Arg163, Arg203, Phe261等を推定した。これら残基の変異体の活性測定により、基質特異性への影響を検証した。N-スクシニル-L-ロイシンに対する各変異体の活性は野生型SadAと比較して5~78%程度に低下していた。一方、T77S変異体については活性が野生型SadAと同程度であった。これらの結果は、SadAのArg83, Arg163, Arg203が基質のN-スクシニル部分のカルボキシル基を結合することで、3位の炭素原子が亜鉛イオンと近接することを示唆していた。また、Gly79及びPhe261がロイシン部分のイソブチル基を認識し、Thr77が基質のロイシン部分のカルボキシル基を認識して基質特異性を規定していることが示唆された。N-スクシニル-L-フェニルアラニンに対しても同様の結果が得られ、申請者は最終的に基質結合モデルを構築することに成功した。さらに、このモデルをSadAの基質特異性を拡大するための分子改変に応用した。その結果、産業上有用なある種のN-スクシニル-アミノ酸に対して、高い活性を示す変異酵素を取得することに成功した。この結果に基づいて、産業上有用な水酸化アミノ酸を合成する実用化酵素の取得が期待される。

以上のように、本研究で得られた知見は、学術上、応用上貢献するところ大であると考えられる。よって、審査委員一同は、本論文が博士(農学)の学位論文として価値あるものと認めた。