General Introduction

The annual production of aquacultured shrimp has been over 3 million tons during the past five years, and continues to increase (FAO, 2010). Three penaeid shrimps, Penaeus monodon, Fenneropenaeus chinensis, and Litopenaeus vannamei accounted for over 86% of total production in 2002. However, the shrimp aquaculture industry harbors severe impediments, such as the outbreak of viral disease and difficulties in inducing reproduction in capacity. Eyestalk ablation is the major means of inducing ovarian development in female shrimp, but it lead to deterioration in spawn quality and quantity over time, in addition to increasing the possibility of infection. Hence, it is important to conduct research relating to the biology and physiology of animals used in aquaculture operations where it is necessary to both control disease and induce reproductive development. The improvement of immune activity may be an effective strategy for the control of shrimp disease (Bachere, 2000). Therefore, physiological studies linking immune response and reproductive development in penaeid shrimp is considered to be of value, and for this reason, studies on Fenneropenaeus chinensis and Litopenaeus vannamei were undertaken.

Chapter 1.Molecular cloning of prophenoloxidase in hemocytes of the fleshy shrimp, Fenneropenaeus chinensis

In the crustaceans, the first step in immune defense is the detection of invading non-self molecules. This is accomplished by the prophenoloxidase activating system (proPO-AS), Firstly, cDNA encoding proPO of F. chinensis (f-proPO) was obtained from hemocytes; it had a full length of 3023 bp, with an open reading frame (ORF) of 2061 bp, a 105-bp 5'-untranslated region, and a 906-bp 3'-untranslated region containing the poly A signal. This 3023-bp f-proPO cDNA encoded a putative protein of 686 amino acids having a molecular mass of 78.1 kDa, and high sequence similarity to proPOs of P. monodon (93%), Penaeus semisulcatus (92%), L. vannamei (88%), and Macrobrachium rosenbergii (80%). These results were utilized in subsequent experiments to elucidate the actions of proPO-AS, and the effects of β-glucan or rutin in immune response in F. chinensis.

Chapter 2.Effects of β-glucan and rutin on immune responses in hemocytes of the fleshy shrimp, Fenneropenaeus chinensis

In several shrimp species, β-glucan and rutin are considered to be immunostimulants that affect to immune response. In order to investigate the effects of dietary β-glucan and rutin as immunostimulants in the absence of pathogen challenge, F. chinensis were fed with β-glucan (0.5 or 1 g kg(–1) diet) or rutin (0.5 or 1 g kg(–1) diet) for 10 days. Total hemocyte count (THC) and the expression of four immune-related genes, those for prophenoloxidase (proPO), peroxinectin (PX), lipopolysaccharide and β-glucan binding protein (LGBP), and c-type lectin (CL), were determined in hemocytes. The THCs of shrimp fed β-glucan at 1 g kg(–1) diet, and rutin at 1 g kg(–1) diet were significantly higher than those of the control (P < 0.05). The expression of proPO mRNA was slightly downregulated, and that of LGBP mRNA was upregulated (except in shrimp fed rutin at 1 g kg(–1) diet). PX and CL mRNA remained constitutively expressed in all groups. The results of this chapter revealed that β-glucan and rutin dietary supplements have minimal effect on immune response in the absence of pathogen challenge, but that rutin is a possible candidate immunostimulant for F. chinensis.

Chapter 3.Effects of cyclic nucleotides and a calcium ionophore on vitellogenin mRNA expression using ovarian incubation in Litopenaus vannamei

In crustaceans, vitellogenesis is considered to be under the negative control of the VIH, a neuropeptide in the crustacean hyperglycemic hormone (CHH) family that is secreted from the X-organ/sinus gland complex in the eyestalks. The actions of peptide hormones are thought to be mediated by signaling pathways such as cyclic nucleotides and Ca2+ in the target organ cells such as ovary and hepatopancreas tissue. The incubation of ovarian fragments was used to investigate whether cyclic nucleotides and Ca2+ are involved in the regulation of Vg mRNA levels in the ovary of L. vannamei. There were no significant differences in Vg mRNA levels when cAMP and cGMP analogues were applied in incubation in dosages ranging from 0.1 to 1000 μM. These results were inconclusive, and made it necessary to further investigate how signaling pathways based on peptide hormones controls vitellogenesis in adult female shrimp.

Chapter 4.Studies on membrane guanylyl cyclase as a crustacean hyperglycemic hormone (CHH) family receptor in Litopenaus vannamei

It was considered possible that the action of peptide hormones may be mediated by receptor guanylyl cyclase, a single-pass transmembrane protein. To investigate whether membrane guanylyl cyclase (mGC) is involved in the regulation of Vg mRNA levels, as a first step, the cDNA sequence of mGC in the ovary of L. vannamei is currently being determined. In order to perform the cloning of this receptor, the specific primers for mGC were designed from a cDNA library, and used for subcloning. Subsequently, mCG mRNA expression will be examined in order to investigate its distribution in somatic tissues. The results of this chapter should shed light on whether a receptor guanylyl cyclase is involved in celluar signaling in vitellogenesis in female shrimp.

Chapter 5.Alterations of pattern in immune response and vitellogenesis during induced ovarian development by unilateral and bilateral ablation in Litopenaus vannamei

Eyestalk ablation is often used to induce ovarian development in female shrimp, but it alters the animal's hormonal balance, and affects its physiology and immune system. Therefore, in this chapter, alterations in patterns of both immune response and Vg levels induced by eyestalk ablation were investigated. Following bilateral ablation, GSI and Vg mRNA levels started to increase after 4 days, and reached peak levels 10 days after ablation. After 20 days, levels became somewhat decreased. Oocyte size increased following ablation; ovaries were at the endogenous vitellogenic stage 10 days later, and at the exogenous vitellogenic stage 20 days later. Analysis of immune-related genes is currently in progress, and primers for real-time PCR have already been designed. The results of this chapter are expected to clarify whether immune response is altered by eyestalk ablation, and whether induced reproduction potentially leads to greater chance of infection.

General Discussion

To establish strategies for the control of disease and develop alternatives to eyestalk ablation in order to achieve more sustainable shrimp aquaculture, it is important to accumulate knowledge from physiological studies concerning shrimp immunology and endocrinology. This study was an attempt to better understand physiological mechanisms in term of both immune response and reproductive development in the penaeid shrimps, F. chinensis and L. vannamei. Therefore, this study has value for creating a new approach to integrating knowledge of gonadal maturation and shrimp immunity, and thus is expected to lead to a better understanding of shrimp physiology.

序論

近年、世界のエビ養殖生産量は年間300万トンを超え、クルマエビ類を中心に未だに拡大を続けている。しかし、エビ養殖の現場では、色々な病気の発生や、親エビを効率よく成熟させる技術が未だ確立されていないことが、大きな問題となっていた。こうした問題の解決のためには病気の防除と親エビの人為催熟技術の確立が望まれている。したがって、効率的かつ持続的なエビ養殖産業の実現のためには、まずエビの免疫反応と性成熟機構の詳細を理解することが極めて重要になる。本研究ではコウライエビFenneropenaeus chinenesis と バナメイエビLitopenaeus vannameiを用い、クルマエビ類における免疫反応と性成熟機構に関する生理学的解明を試みた。

第1章 コウライエビにおける prophenoloxidase(proPO)遺伝子のクロニング

本章では、 全長 のproPO 遺伝子のcDNA配列を決定した。コウライエビのproPO遺伝子のcDNAは3023 bpをコードし、686残基のアミノ酸配列が推定された。このアミノ酸配列には 他の甲殻類や無脊椎動物でのproPOと同様に、二つのcopper binding site と thiol ester-like motifが保存されていることが分かった。さらに、推定されたコウライエビのproPOアミノ酸配列を他の甲殻類proPOと比較した結果、ウシエビと93%, クマエビと92%, バナメイエビと88%, クルマエビと82%の相同性があることが分かった。これらの結果から、コウライエビのproPO遺伝子は血球細胞で発現し、他のクルマエビ属のproPO遺伝子との相動性が高いことから同様な作用を持つと予想される。

第2章 コウライエビの免疫反応におけるβ-グルカンおよびルチンの影響

本章では、β-グルカン及びルチンを免疫刺激源として今回の実験で使用し、十日後 免疫反応の効果を調べるため、この二つの物質をコウライエビに食べさせることで総血球細胞数と第1章で同定したproPO遺伝子を含め、四つの免疫関連遺伝子の発現量の変化を試みた。β-グルカン及びルチンの投与によって、四つの免疫関連遺伝子の発現量には有意な変動がみられなかった。しかし、総血球細胞数では有意な増加がみられたことが分かった。この結果から、β-グルカンとルチンはコウライエビの免疫刺激源の候補物質である可能性があることが考えられる。今後、免疫反応をより高めるための量と時間に関する研究を行うことが必要であると考えられるが、免疫刺激物質を食べさせることで病気に強いエビ養殖が期待される。

第3章 バナメイエビ卵巣の卵黄タンパク質遺伝子発現に及ぼすcyclic nucleotides及びcalcium ionophoreの影響

本章では、 対照区には何も加えず、実験区には各種のcyclic nucleotides及びcalcium ionophoreを加えた液体培地中でバナメイエビの卵巣片を培養し、卵黄タンパク質遺伝子発現量の変化を調べた。その結果、cAMP analogue、 cGMP analogue 及びIBMX を添加した培養実験では、卵黄タンパク質遺伝子発現量に有意な変化は見られなかった。一方、Calcium ionophore については、0.1 µMを添加した8時間後、および1 µMを添加した 8および24時間後において、対照区に対して有意な卵黄タンパク質遺伝子発現量の減少が認められた。本研究により、カルシウムイオンがバナメイエビ卵巣における卵黄タンパク質遺伝子の発現制御に関わっている可能性が示唆された。

第4章 Crustacean hyperglycemic hormone (CHH) family のレセプターと推定される membrane guanylyl cyclaseの探索

脱皮抑制ホルモンおよびCHH family peptideについての他の研究ではmembrane guanylyl cyclase (mGC)が CHH family peptide のreceptorと予想された報告があり、この可能性を確認するため、最初にバナメイエビの卵巣から1571bpのmGC遺伝子のcDNA塩基配列を決定し、 mGC遺伝子について組織ごとの発現の有無を調べた。mGC遺伝子は調べた全ての組織で発現が認められた。このような、複数の組織でmGC遺伝子が発現することはこれらの組織でmGC遺伝子が同様な機能を持つ可能性があると思われる。次にサイナス線抽出物を加えた培地中で卵巣を8時間培養したのち、mGC遺伝子の発現量を分析した結果、mGC遺伝子発現量の変化は認められなかった。mGC遺伝子の発現量の変化は8時間以上の時間が必要になる可能性が考えられるため、今後、他の培養時間について実験を行う必要があると考えられる。

第5章 バナメイエビの眼柄切除後の卵巣における卵黄形成と免疫反応の動態

本章では、眼柄の片側、または両側を切除した後、卵巣発達に伴う免疫反応の変化を調べることで、眼柄切除が免疫反応の動態に与える影響を試みた。バナメイエビの眼柄切除後の卵巣では、4日以後、卵黄タンパク質遺伝子発現量の増加ならびに組織学的な卵細胞の発達が認められた。その際、総血球数は片側切除の場合は切除後30分において有意に増加し、両側切除の場合には切除後20日に減少した。血球細胞における免疫関連遺伝子発現量を調べた結果、両側眼柄切除区の20日においてprophenoloxidaseおよびperoxinectin遺伝子の上昇が認められた。本研究により、眼柄切除により卵巣発達促進と同時に起こる免疫反応の一端が明らかとなった。

総合考察

本研究では、エビの免疫及び性成熟に関する各実験の上、新たなアプローチとして卵巣の成熟と免疫をリンクさせて眼柄切除による卵巣発達と免疫反応の動態との関連を試みた。以上の実験結果により、眼柄切除によって卵巣の発達が促進されるだけでなく、エビの体内では免疫的な反応も起こっていることが予想された。本研究から得られた成果を応用して、例えば、β-グルカン、ルチンなどの免疫刺激を与えてエビの免疫活性を上昇させることで眼柄切除による死亡率の上昇や卵質および産卵数の低下などのリスクを軽減できると考えられる。 エビの生理学の分野において新たな知見が得られたものと考える。

以上により、審査委員一同は、本論文が博士(農学)の学位論文として価値あるものと認めた。