Viral hemorrhagic fever (VHF) is a serious illness characterized by extensive vascular damage and bleeding diathesis, fever, and multiple organ dysfunction. Infection of variety of viruses results in similar clinical manifestation of VHF, however, mode of transmission, reservoir animals and clinical outcome including fatality rate in humans are different among VHFs.

These viruses causing VHF are distributed throughout four virus families, the Arenaviridae, Bunyaviridae, Filoviridae, and Flaviviridae. Several of these viruses cause severe VHF with high morbidity and mortality and can be highly infectious by aerosol dissemination, promoting serious concern about weaponization of these pathogens. Amongst these pathogens, Lassa virus and South American hemorrhagic fever virus, which consists of 5 virus species, are arenaviruses.

Currently, there are no specific treatments approved for use against arenavirus hemorrhagic fevers. Present disease management consists of general supportive care; monitoring and correcting fluid, electrolyte and osmotic imbalances and treating hemorrhage with clotting factor or platelet replacement. Convalescent immune serum therapy may be effective in treating cases of VHFs caused by Junin and Machupo virus infection, but the availability of such serum is extremely limited.

The only arenaviral hemorrhagic fever for which studies have been undertaken toward development of a vaccine has been Argentine hemorrhagic fever (AHF) caused by Junin virus. A live-attenuated vaccine, called Candid #1, has been evaluated in controlled trials among agricultural workers in AHF-endemic areas, where it appeared to reduce the number of reported AHF cases with no serious side effects. It is not known if the Candid #1 vaccine would be effective against other South American hemorrhagic fevers. In addition, this vaccine is available only in Argentine.

As these viruses are categorized into BSL4 pathogens in many countries thus can be handled only in specific institutions with BSL4 facilities, analysis of pathogenesis of these pathogenic arenaviruses, development of therapeutic agents and vaccines for arenaviral hemorrhagic fevers have been impeded. In addition, epidemic areas of these diseases are mainly located in developing countries, that is, Sub-Saharan Africa and South America. Pharmaceutical companies have not been given their prior attention to develop medicines for these infectious diseases because of the profits generated from them.

To solve these problems, in Chapter 1 of this study, I have developed vesicular stomatitis virus (VSV) pseudotypes bearing Lassa virus (LASV) envelope protein (LASpv) and Junin virus (JUNV) envelope protein (JUNpv), respectively. LASpv and JUNpv generated in several mammalian cell lines exhibited high infectivity in various mammalian cell lines. Arenaviral envelope proteins on the VSV pseudotypes were glycosylated by high-mannose type oligosaccharide. Endosomal low pH-induced endocytosis of VSV pseudotypes was confirmed by the use of lysosomotropic agents. Low pH induced membrane fusion by Lassa and Junin envelope protein was monitored by syncytium formation and reporter gene activities. The infection of JUNpv to Huh7 cells was mediated by binding to human transferrin receptor 1 (hTfR1) as a receptor. Involvement of cathepsin L in JUNpv cell entry was suggested. These results found in Chapter 1 indicate that the VSV pseudotypes developed in this study can be used to study arenavirus envelope proteins with respect to the biological functions including receptor interaction in the entry process. In addition, a gene encoding the envelope protein of JUNV or LASV is not encoded in VSV gene. Thus the VSV pseudotypes do not produce infectious progeny virus, so that they can be safely handled in a BSL2 containment level.

In Chapter 2 of this study, I have developed a neutralization (NT) assay using a novel VSV pseudotype bearing JUNV glycoprotein (GP) and the NT has been shown to be equally sensitive and specific in detection of neutralizing antibodies compared to NT using infectious JUNV. Cross-reactivities of antibodies in AHF patients' sera with Machupo, Guanarito, Sabia and Chapare viruses were also analyzed by the NTs using VSV pseudotypes bearing the respective viral GPs, IgG-ELISAs using the respective viral nucleoproteins (NPs) and indirect immunofluorescence assays (IFAs) using the respective viral NP expressing cells. AHF patients' sera have been shown to cross-react to other clade B arenaviruses in IgG-ELISA and IFA. However, there was no cross-neutralization at all to other arenaviruses causing South American hemorrhagic fever in the NT using VSV pseudotype, indicating the NT is useful in differential diagnosis among South American hemorrhagic fever.

Through these studies, I have developed safe research tools for arenaviruses, and useful diagnosis methods for AHF. These tools and diagnosis methods can be used in almost all research institutes all over the world at BSL2 or lower level. I think the present study could contribute the research and development of treatment and prevention methods for arenavirus HF.

ウイルス性出血熱(VHF)は出血、発熱、多臓器不全を特徴とする重篤な疾患である。VHFは様々なウイルスの感染によって起こり、ほぼ同様の臨床症状を示すが、ウイルス毎に伝播の様式、レゼルボアおよび致死率を含めた臨床経過は異なる。VHFの原因ウイルスはアレナウイルス科、ブニヤウイルス科、フィロウイルス科およびフラビウイルス科に属している。ラッサウイルスと5種の南米出血熱ウイルスはアレナウイルス科のウイルスである。

現在、アレナウイルス性出血熱の確立された特異的な治療法はなく、輸液による電解質と浸透圧のインバランスの補正、および凝固因子や血小板置換による出血対策が柱となっている。免疫血清療法は、フニンウイルスおよびマチュポウイルス感染によるVHFの場合には有効かもしれないが、それらの血清は限られており、入手は難しい。フニンウイルスによって引き起こされるアルゼンチン出血熱(AHF)は唯一ワクチン開発が進められており、Candid #1と呼ばれる弱毒生ワクチンはAHF流行地域の農業労働者において評価中であり、現在までのところ重大な副作用も無く、AHFの発生件数は減少したと理解されている。しかし、Candid #1ワクチンが他の南米出血熱に対して有効であるかは不明である。さらに、このワクチンはアルゼンチンでのみ利用可能で、他の国では使用できない。

上記のアレナウイルスは多くの国々でBSL4の病原体に分類されており、BSL4設備を持った特定の機関でしか扱えず、このことが高病原性アレナウイルスの病原性の解析、治療薬やワクチンの開発の障害となっている。さらに、これらの疾病の流行地域は、主として開発途上国(アフリカのサハラ砂漠周辺と南アメリカ)であり、製薬会社は収益が見込まれないため、これらの疾病のための創薬には力を注がない。

これらの問題を解決するために、第1章ではラッサウイルス(LASV)エンベロープタンパク質(LASpv)およびフニンウイルス(JUNV)エンベロープタンパク質(JUNpv)を外套した水疱性口内炎ウイルス(VSV)シュードタイプを開発した。いくつかの哺乳類細胞株で作製されたLASpvとJUNpvは、様々な哺乳類細胞株で高い感染力を示した。VSVシュードタイプ上のアレナウイルスエンベロープタンパク質は高マンノース型のオリゴ糖によって糖鎖修飾を受けていた。シュードタイプウイルスの低pH依存的エンドサイトーシスはリソソーム由来試薬によって確認された。また、ラッサウイルスとフニンウイルスのエンベロープタンパク質の低pH環境による膜融合を合胞体形成やリポーター遺伝子の活性によって検討した。JUNpvのHuh7細胞への感染は、ヒトトランスフェリン受容体1型(hTfR1)を受容体として利用していた。また、JUNpvの細胞への侵入にはカテプシンLの関与が示唆された。これらの結果はVSVシュードタイプがアレナウイルスのエンベロープタンパク質のウイルス受容体相互作用などの生物学的機能の解析に有用であることを示している。しかも、JUNVやLASVのエンベロープタンパク質の遺伝子は、ウイルス遺伝子の中にはコードされていないので、VSVシュードタイプは感染性子孫ウイルスを産生できず、BSL2レベルの封じ込めで安全に取り扱うことができる。

第2章では、JUNV糖タンパク質(GP)を外套したVSVシュードタイプを用いたウイルス中和アッセイ法(NT)を開発した。VSVシュードタイプを用いたNTは、感染性ウイルスを用いたNTと感度や特異性が等しいことが示された。AHF患者抗体のマチュポウイルス、ガナリトウイルス、サビアウイルスおよびチャパレウイルスに対する交差反応性を、それぞれのウイルスの糖タンパク質を外套したVSVシュードタイプを用いたNT、それぞれのウイルスの核タンパク質(NP)を抗原とするIgG-ELISA、およびそれぞれのウイルスのNPを発現する培養細胞株を標的とする間接免疫蛍光抗体法(IFA)によって評価した。AHF患者血清はIgG-ELISAおよびIFAで、他のアレナウイルスと交差反応した。しかしながら、NTでは他の南米出血熱ウイルスと交差反応せず、VSVシュードタイプを用いたNTは南米出血熱の鑑別診断に役立つことが示された。

以上の結果は、アレナウイルスのための安全な研究ツールおよびAHFのための有用な診断手法を開発され、かつこれらのツールと診断手法は世界中の研究所のBSL2か、より低レベルの封じ込めで使用可能であることを示している。また、これらの研究成果はアレナウイルス性出血熱の更なる研究と治療法および予防法の開発にも寄付するものと考えられる。したがって、これらの研究成果は公衆衛生および獣医学学術上貢献するところが少なくない。よって、審査委員一同は、本論文が博士(獣医学)の学位論文として価値のあるものと認めた。