More than half a billion years ago a dramatic event happened in the evolution of Earth: a whole genome duplication of the jawless fish resulted in the appearance of vertebrates carrying a double load of genes. Ability to simultaneously integrate both sensory (bottom-up) and higher cognitive processing (top-down) stimuli of the complex milieu had being given a boost and had successfully evolved into the emergence of mammals and subsequently into humanoid-like creatures claiming to possess a higher cognitive abilities than their precedents and other close evolutionary related species. And this is likely how the subneofunctionalization of several paralogue genes had started with the Netrin-Gs among them. Originally derived from the cell adhesion (laminin) and guidance cue superfamilies (netrins) Netrin-G1 (G1) and Netrin-G2 (G2) are both unique in their ability of being attached to the presynaptic membrane and brain-restricted appearance. Their self-exclusive pattern of expression in the brain areas and participation in the brain laminar structure formation points towards a discernable dissociation of their function in the information segregation flows.

Both, G1 and G2 show an extraordinary level of protein conservation among the vertebrates with 100% and 99% identity between the human and apes, 97% and 88% between the mice and humans, 67% and 57% between the human and tetrapod fish coelacanth, respectively. Two coding areas within the both genes (Ukd domain and GPI-link) underwent an accelerated evolution with the simultaneous great expansion of the preceding introns. Single nucleotide substitutions from them are seemed to play a key role in the Netrin-Gs subneofunctionalization and, as a result, adopting the de novo evolving cognitive features. To test this, schizophrenic patients (G1: n=61, G2: n=59, controls: n=143) carrying SNPs for either G1 or G2 genes underwent IQ tests (WAIS-III). The results unequivocally demonstrate a dramatical effect of a single SNP for each gene on the cognitive subdomain performance with G1 SNP affecting verbal comprehension (p = 0.0037) and G2 working memory (p = 0.0031) information flow.

Human psychogenetics data fully corroborate the observations in the mice cognitive phenotype abnormality, with G2 but not G1 upregulated by the cognitive task and a smaller brain size for the both KO mice upon the life-time intensive cognitive training comparing to the wild-type. Despite G1 and G2 have an identical gene and protein domain structures the function they perform is definitely not the same but rather complementary to each other comprising the unit of cognition.

ヒト認知機能の発達において進化過程での遺伝子の多様化と神経回路特異的発現特性の獲得は根幹的意義を持つ。脊椎動物固有遺伝子の分子進化はとりわけ重要な役割を果たしたと考えられる。PAVEL PROSSELKOVはこのような遺伝子として、同一遺伝子ファミリーに属し、独立した受容体を持ち、脳内での発現特性が相互排他的である特徴を持つシナプス因子Netrin-G1(NTNG1)とNetrin-G2(NTNG2)に着目し、これらの分子進化過程を分析し、マウスにおける発現の多様性を明らかにし、さらにヒトの遺伝学的解析とマウスにおける遺伝子動態の解析を行った。これらの結果を元に、両遺伝子の分子進化が認知機能の進化に果たした意義を考察した。

まず、ヒトおよびマウスではNetrin-G1mおよびNetrin-G2bが最長アイソフォームである事を明らかとし、これを基準として体系的にオーソログを探索し、分子進化の概要を明らかとした。Ntrin-G1はNGL1とNetrin-G2はNGL2と特異的に結合し、この結合の三次構造は解明されている。結合ドメインの特異的アミノ酸配列は、フグ(4.5億年前)で初めて出現したこと、ヒト遺伝子のExon(5-10)がパラログの多様化に大きく貢献したが、Exon6-7が進化的に最も新しく、マウス(0.9億年前)で初めて認められた。進化の歴史が若いExon-Intron構造に着目し、Netrin-Gパラログの転写産物を詳しく解析し、以下の事を明らかとした。

1)転写産物は極めて多様であり、マウスNtng1には3クラス(GPIリンク型、GPI非リンク分泌型、非コード型を併せて19種類)が、マウスNtng2には5クラス(GPIリンク型、GPI非リンク分泌型、非コード型、第二プロモータ転写型、単翻訳枠型を併せて20種類)が存在する。

2)Exons6-7はアイソフォーム発現量比に大きく影響し、これらのExonsを含むNtng1アイソフォームは含まないものに比べて多く、Ntng2においては逆の関係である。

3)両遺伝子とも、GPI非リンク分泌型は相対的に少なく、調節的役割が想定される。

4)アイソフォーム比は脳の領域間で異なる。

これらの結果は、両遺伝子が進化の過程で機能的に大きく多様化した事を示している。

PAVEL PROSSELKOVはスプライシングによる多様なNtngアイソフォーム形成がヒトの認知機能の発達に重要な意義を持ったこと、intron内の塩基置換がNetrin-Gの機能分化と認知機能獲得に貢献したとの仮説を立てた。この仮説に基づいて、11個のSNPとWAIS-III検査値との関連を解析した。NTNG1のExon 5下流に位置するrs2218404とNTNG2のExon 5上流に位置するrs2274855が統合失調症患者内でのWAIS値に有意な影響を示した。NTNG1 SNP rs2218404の(T/GとT/T)患者はG/G患者に比べて言語性IQ、全検査IQ、言語理解で有意な低値を、NTNG2 SNP rs2274855の(A/GとA/A)患者はG/G患者に比べて有意に言語性IQ、動作性IQ、全検査IQ、作業記憶等で低値を示す事を明らかにした。

Ntngの発現に経験が影響するのか、そうであるならNetrin-Gs間に相互作用が有るのか明らかにする為、複数の行動解析パラダイムを経験あるいは経験しなかった老齢の野性型、Ntng1-KOおよびNtng2-KOマウス、野生型アダルトで文脈依存的恐怖条件付け訓練を経験、電気ショックのみ経験あるいは飼育コントロール群についてNtng1およびNtng2の発現レベルを解析した。Ntng2遺伝子は、加齢によって発現が顕著に増加し、認知訓練は一層の増加を促す傾向であり、短時間の電気ショックも有為な影響を示した。Ntng1欠損により加齢と訓練によるNtng2発現増強効果は消失した。Ntng1は加齢によってやや発現レベルの亢進を示したに留まり、Ntng2欠損による影響も受けなかった。さらに、経験は脳重量の増加を野生型に誘導したが、この変化はNtng1-KOおよびNtng2-KOマウスに観察しなかった。これらの結果は、Netrin-G1とNetrin-G2が独立した機構で脳機能に貢献する事を示唆している。

以上の結果は、Netrin-G1とNetrin-G2の分子進化がヒトおよび高等脊椎動物における認知機能の発達で重要な役割を担い、相互補完的に働く事を示唆した。これらの研究成果は、獣医学学術上貢献するところが少なくない。よって、審査委員一同は、本論文が博士(獣医学)の学位論文として価値のあるものと認めた。