ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)はエンベロープを有するプラス鎖の一本鎖RNAウイルスで、レトロウイルス科レンチウイルス属に分類される。HIVのゲノムは大きく分けてGag、Pol、Vif、Vpr、Vpu、Tat、Rev、Env、Nef という9種類のウイルスタンパクをコードしている。HIV-1は自己のゲノムの逆転写産物を宿主細胞の染色体に組み込むという性質を持っており、慢性持続感染を成立させ、後天性免疫不全症候群(acquired immunodeficiency syndrome, エイズ)を引き起こす。現在は、抗レトロウイルス薬を組み合わせた多剤併用療法(Highly Active Anti-Retroviral therapy, HAART)によってウイルス複製を抑制し、エイズ発症を遅延させることが可能になっている。しかし、HIVの感染拡大を防ぐには予防的措置は必要不可欠であり、予防エイズワクチン開発は急務とされている。

HIV-1に対するワクチンの評価・検討や、HIV 複製抑制機構の解析において HIV-1感染によってエイズ発症に至る動物モデルが理想的とされるが、そういった動物モデルは現在までに報告されていない。そこで、霊長類動物レンチウイルス感染モデルが最適の評価モデルとされ、主に病原性サル免疫不全ウイルス(Simian Immunodeficiency Virus, SIV)またはサルヒト免疫不全ウイルス(Simian/Human immunodeficiency virus, SHIV)感染マカクモデルが用いられている。

HIV感染症においてウイルス複製抑制に有効な免疫としては、主に細胞傷害性Tリンパ球(CTL)と中和抗体が挙げられる。HIV/SIV感染症の病態進行は、ウイルス抗原をCTLに提示する抗原提示分子である主要組織適合遺伝子複合体クラスI(Major histocompatibility complex, MHC-I)の遺伝子型に大きく影響される。HIV/SIV抗原の中でも特にGag特異的CTL誘導はHIV/SIV複製抑制と相関することが報告されており、Gagをワクチン抗原とする予防エイズワクチン開発が進められてきている。

本研究室でも、Gagを抗原としたDNAプライム/Gag発現センダイウイルスベクターブーストワクチンの検討が行われてきた。中でもMHC-Iハプロタイプ90-120-Ia共有アカゲザル群は非ワクチン接種の状態においてSIVmac239チャレンジ後にGag特異的CTLが優位に誘導される群であり、この群にGagを抗原としたワクチン接種を行うことで、SIV複製制御に至ることを報告している。このアカゲザル群は、Gagの中にGag(206-216)(IINEEAADWDL)、Gag(241-249)(SSVDEQIQW)、Gag(373-380)(APVPIPFA)という3つのCTLエピトープを有しており、これらのエピトープ特異的CTLからの認識を低下させるエスケープ変異(L216S、D244E、A373T)の出現が確認されている。Gagワクチン群へのエスケープ変異体チャレンジ実験によって3つのGagエピトープ特異的CTLの初期SIV複製制御における重要性が示された。しかし、MHC-I 90-120-Ia共有SIV複製制御群において長期SIV複製制御の維持に関わる免疫応答については明らかとなっていない。そこで本研究では、MHC-I 90-120-Ia共有SIV複製制御群の長期SIV複製制御機序の解析及びそこから見出された結果を元に新たにワクチン実験を行った。

まず、長期SIV複製制御に関わる免疫応答の解析では、初期SIV複製制御に関わるCTL応答と長期SIV複製制御維持に関わるCTL応答の違いを明らかにするため、Gagワクチン接種後、長期SIV複製制御に至ったMHC-I 90-120-Ia共有アカゲザル群8頭に対して、3つのGag特異的CTLからのエスケープ変異5つ(GagL216S、GagD244E、GagI247L、GagA312V、GagA373T)を有するSIV-G64723mtのスーパーチャレンジを行った。その結果、SIV特異的中和抗体の誘導なくして全頭でSIV-G64723mt複製制御に至った。そこで、Gagワクチン接種後からスーパーチャレンジ後まで経時的にin vitroにおけるCD8陽性細胞のSIV複製抑制能の解析に加え、IFN-γ産生によるSIV特異的CTL応答の解析を行った。まず、in vitroにおけるCD8陽性細胞のSIV複製抑制能の解析では、SIVmac239およびSIV-G64723mtに対するCD8陽性細胞のSIV複製抑制能の解析を行った。SIVmac239に対してはワクチン接種後のCD8陽性細胞は高いSIV複製抑制能を示したが、SIV-G64723mtに対しては複製抑制能を示さなかった。この結果から、SIVmac239に対する複製抑制では、Gag(206-216)、Gag(241-249)、Gag(367-381)特異的CTLが中心的な役割を果たすことが示唆された。SIVチャレンジ後になると、いずれの個体でもSIV-G64723mtに対する複製抑制が認められ、SIV感染後時間経過に伴い、SIV-G64723mtに対して高いSIV複製抑制能を示す傾向が認められた。また、SIVmac239複製抑制能とSIV-G64723mt複製抑制能に相関は認められなかった。この結果から、SIV複製制御群のCD8陽性細胞はSIV感染慢性期にSIV-G64723mtに対する複製抑制能を獲得したことが明らかとなった。SIV特異的CTL応答の解析では、ワクチンによって誘導したGag特異的CTLに加え、SIV感染後には複数の抗原特異的CTLの誘導が認められた。CD8陽性細胞によるSIV複製抑制能とSIV特異的CTLレベルの相関を解析したところ、SIVmac239複製抑制能はGag(206-216)およびGag(241-249)特異的CTLレベル、Vif特異的CTLレベル、Nef特異的CTLレベルと相関が認められた。一方、SIV-G64723mt複製抑制能はVif特異的CTLレベルのみと相関が認められた。以上の結果から、ワクチン接種長期SIV複製制御群のSIVmac239チャレンジ後のCTLの動態が明らかとなった。この研究は、長期のSIV複製制御の間にCTLエスケープ変異を有する変異体SIVを複製抑制可能なCD8陽性細胞が誘導されることを示唆しており、SIV複製制御群における広範なCTL応答誘導機序の解明は、多様性に富んだHIVに対するワクチン開発に大きく寄与すると考えられる。

次に我々は、この結果をもとに、MHC-I 90-010-Ie共有アカゲザル群19頭においてGag、Vif、Nefのワクチン抗原としての有効性の検討を行った。このうち8頭が非ワクチン接種群、5頭がGagワクチン群、6頭がVif/Nefワクチン群である。また、MHC-I 90-010-Ie共有アカゲザル群はSIV感染後にNef特異的CTLを優位に誘導する群であるため、GagおよびVif特異的CTLが優位に誘導されない群におけるワクチンによるsubdominant GagまたはVif特異的CTL誘導がSIV複製にどのような影響を与えるのかについても解析を行った。SIVmac239チャレンジの結果、非ワクチン接種群ではいずれの個体も高ウイルス血症を示した。Gagワクチン群では5頭中3頭がSIV複製制御に至り、SIV複製制御群ではSIV感染急性期にGag特異的CTLが高頻度で誘導されていた。一方、Vif/Nefワクチン群では6頭中3頭が血漿中ウイルス量の低下を示した。Vif/Nefワクチン群でウイルス量の低下を示した個体では、SIV感染急性期にVif特異的CTLが優位に誘導されており、非SIV複製制御個体ではNef特異的CTLのみが誘導されていた。SIV感染後2週のVifまたはNef特異的CTLレベルとSIV感染後慢性期の血漿中ウイルス量の相関を解析したところ、Vif特的CTLレベルは血漿中ウイルス量と有意な逆相関を示し、Nef特異的CTLレベルは血漿中ウイルス量と有意な相関を示した。また、Vif/Nefワクチン群においてワクチンによって誘導されたCTL誘導パターンがSIV複製制御に与える影響を解析するため、Vif特異的CTLレベルとNef特異的CTLレベルの比をとり、SIV感染後慢性期の血漿中ウイルス量と相関を調べたところ、Vif/Nef CTL比はSIV感染後6ヶ月および1年の血漿中ウイルス量と優位な逆相関を示した。

これらの結果はprotective alleleを持たないアカゲザル群においてワクチンによるVif特異的CTL誘導がSIV複製制御における有効性を初めて報告した点で重要である。また、subdominant CTLをワクチンによって誘導することの妥当性を証明した。

本研究では、長期SIV複製制御群におけるSIV特異的CTLの解析を行い、Gagエピトープに加え、VifおよびNef特異的CTL頻度がin vitroにおけるCD8陽性細胞のSIV複製抑制能と相関することを見出した。この結果をもとに、Gag、Vif、Nefを抗原としたCTL誘導ワクチン接種実験を行ったところ、ワクチンによるCTLメモリー誘導がSIV曝露後感染急性期のGag特異的CTLあるいはVif特異的CTL反応誘導に結びつくことでSIV複製制御につながることが明らかとなった。本研究は予防エイズワクチン開発の抗原選択において重要な知見を与えるものである。

本研究では、HIV複製制御に結びつく免疫機序の解明に向け、サル免疫不全ウイルス(SIV)感染サルエイズモデルにおける細胞傷害性Tリンパ球(CTL)反応の解析を行った。まず、DNAプライム/センダイウイルスベクターブーストワクチン接種によるGag抗原特異的CTL誘導によって、SIVmac239チャレンジ後1年以上の長期SIV複製制御に至った主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスIハプロタイプ90-120-Ia共有アカゲザル群において、SIV複製制御維持に関わる免疫応答の解析を行い、下記の結果を得た。

1.ワクチン接種・SIVチャレンジ後SIV複製制御に至った90-120-Ia共有サルの慢性期に、90-120-Ia共有群のSIV複製制御に中心的役割を果たすことが判明している3つのGagエピトープ (Gag(206-216)、Gag(241-249)、Gag(373-380)) 特異的CTLからの逃避変異を有する変異SIV(SIV-G64723mt)を用いたスーパーチャレンジ実験を行った結果、変異SIVの複製が制御されることが明らかとなった。ワクチン接種後の変異SIVチャレンジ実験では複製制御に至らないことから、これらの長期SIV複製制御群では、野生型SIVチャレンジ後に変異SIV複製制御能を獲得したと考えられた。

2.SIVチャレンジ後に獲得した変異SIV複製制御能に関する知見を得るため、ワクチン接種後からスーパーチャレンジ後までのCD8陽性細胞のSIVmac239およびSIV-G64723mtに対する複製抑制能をin vitro viral suppression assayにより経時的に解析した。なお、いずれの個体においてもSIV特異的中和抗体誘導は認められなかった。ワクチン接種後のCD8陽性細胞は、SIVmac239複製抑制能を示したが、SIV-G64723mtに対しては複製抑制能を示さなかった。しかし、SIVチャレンジ後のCD8陽性細胞はSIVmac239およびSIV-G64723mt双方に対して高いSIV複製抑制能を示した。このことから、SIVmac239チャレンジ後に誘導されたSIV特異的CTL応答がSIV-G64723mt複製制御に関与したことが示唆された。

3.SIVチャレンジ後のSIV特異的CTL応答を解析した結果、SIVチャレンジ後早期からGagのみならず、複数のSIV抗原特異的CTLが誘導されていた。そこで、in vitroのCD8陽性細胞のSIV複製抑制能とSIV特異的CTLレベルの相関解析を行った結果、SIVmac239複製抑制能はGag(206-216・241-249)エピトープ、Vif、Nef特異的CTLレベルと相関が認められ、SIV-G64723mt複製抑制能はVif特異的CTLレベルと相関が認められた。

これらの結果は、長期SIV複製制御群における細胞性免疫応答のダイナミクスを示すものであり、さらに、CD8陽性細胞のSIV複製抑制能と特定のSIV抗原特異的CTL反応との相関を明らかにした点でも重要である。

これらの結果から、これまで指摘されてきたGag抗原特異的CTLの有効性のみならず、VifおよびNef抗原特異的CTLの有効性が示唆されたことから、ワクチンによるこれらの抗原特異的CTLメモリー誘導がSIV複製制御に結びつくかどうかを検討することとした。本実験では、元来Gag特異的CTL反応が優位に誘導されるMHC-Iハプロタイプ90-120-Ia共有群とは異なり、ワクチン非接種ではSIVチャレンジ後にGag特異的CTL反応が優位に誘導されずNef特異的CTL反応が優位に誘導されるMHCクラスIハプロタイプ90-010-Ie共有アカゲザル群を用いて解析を行うこととした。ワクチンによるGag、Vif、Nef特異的CTL誘導がin vivoのSIV複製に与える影響の解析を行い、下記の結果を得た。

4.Gagワクチン接種群では、5頭中3頭でSIV複製制御に至り、SIV複製制御個体では、SIV感染急性期にGag特異的CTLが高頻度で誘導されていた。このことから、MHCクラスIハプロタイプ90-010-Ie共有アカゲザル群においてもワクチン接種によるSIV感染急性期の効率の良いGag特異的CTL誘導が初期SIV複製制御に有効であることが示唆された。

5.Vif/Nefワクチン接種群では、6頭中3頭でSIV複製制御に至り、特にSIV感染急性期にVif特異的CTLが優位に誘導された個体でSIV複製制御に至った。興味深いことに、感染急性期のVif特異的CTLレベルとNef特異的CTLレベルの比は、感染後6ヶ月および1年の血漿中ウイルス量と顕著な逆相関を示した。この結果から、ワクチンによるCTLメモリー誘導がSIV曝露後急性期の優位なVif特異的CTL誘導に結びつけばSIV複製制御に至る可能性が示された。

これらの結果は、MHC-Iハプロタイプ90-120-Ia共有群および90-010-Ie共有群の解析で得られたものであり、Gag特異的CTL・Vif特異的CTLの有効性が特定のMHC-Iハプロタイプ由来のMHC-I拘束性エピトープ特異的CTL反応に限局するものでなく、一般論として適応できる可能性が高いと考えている。

以上、本論文は、protective alleleを持たないアカゲザル群において、予防ワクチン接種が、SIV曝露後急性期のGagまたはVif特異的CTL反応の優位な誘導に結びつけば、SIV複製制御に至りうることを示した。特に、感染急性期の優位なVif特異的CTL反応がSIV複製制御に貢献しうることを示した初めての報告である。これらの結果から、HIV曝露後急性期の優位なGagおよびVif特異的CTL反応誘導に結びつくワクチン戦略の合理性が示唆された。このように本論文は、HIV複製制御に結びつく免疫機序の解明に資するものであることに加え、CTL誘導型予防エイズワクチン開発における抗原選択において有用かつ重要な情報を提供するものであり、学位授与に値するものである。