Introduction

Emergence of resistant bacterial strains shortly after the clinical use of antibiotics has made infections difficult to treat. In order to continuously overcome the infectious diseases, discovery of novel antimicrobial agents with novel mechanism of action is utmost important. Despite the need of the novel antimicrobial agents, less attention is paid by pharmaceutical industries on this field due to poor outcomes. Although many screening programs have attempted to identify antimicrobial agents, the discovery of therapeutically effective novel compounds is very difficult and has not been reported in recent years. This can be attributed to the conventional method of antibiotic discovery, in-vitro screening followed by in-vivo screening, where ethical issues make it difficult for the use of animal models at the early stage of drug development. In fact, the use of mammalian models to examine the pharmacodynamics requires larger and sophisticated space, skilled personnel; is costly and associated with ethical issues. To address these issues, I propose use of silkworm infection model for identification of novel therapeutically effective antimicrobial agents. Silkworm model not only reduces the time and cost of experiments, but also requires less space and there are no ethical issues surrounding its use. Here, I summarize the identification of two novel therapeutically effective antimicrobial agents: kaikosin E and compound 363 by using silkworm bacterial infection model. Moreover, a detailed insight on the identification of mechanism of action of these antimicrobial agents is provided.

Results

I. Kaikosin E

a. Characterization of kaikosin E: Kaikosin E, a novel therapeutically effective antibiotic, was isolated from culture supernatant of a lysobacter species by using silkworm infection model. Kaikosin E was effective against silkworm infected with Staphylococcus aureus with an effective dose fifty (ED(50)) value of 0.3 μg/g・arva. It was also effective in mouse infection model with an ED(50) value of 0.6 mg/kg, more potent than vancomycin. The structure of kaikosin E was elucidated by MS/MS and NMR analyses as shown in Figure 1. Kaikosin E is a cyclic lipopeptide containing 12 amino acid residues and a short fatty acid chain with a molecular mass of 1617. It was effective against Gram-positive bacteria including methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) with minimum inhibitory concentration (MIC) value of 4 μg/ml and was also effective against Mycobacterium (MIC: 8 μg/ml). Kaikosin E inhibited the biosynthesis of the macromolecules DNA, RNA, protein, and peptidoglycan in exponentially growing S. aureus. It exerted bacteriolytic activity and showed bactericidal activity with killing of 99% of bacteria within one minute of exposure to it. It dissipated the membrane potential in S. aureus even at concentrations much lower than that of MIC value suggesting the potent membrane damaging effect (Figure 2). Mice did not die when injected with a dose of 400 mg/kg kaikosin E, i.e., the ratio of lethal dose fifty to effective dose fifty (LD(50)/ED(50)) was more than 600 indicating the wide range of therapeutic index and low toxicity. Based on its therapeutic activity and low toxicity, kaikosin E has a strong potential to be a candidate for clinical application.

b. Cellular target of kaikosin E in S. aureus: To reveal the cellular target of kaikosin E, I isolated mutants of S. aureus resistant to it. S. aureus strain RN4220 was treated with a mutagen ethyl methanesulfonate and cultured on agar plates with different concentrations of kaikosin E. Resistant mutants that grow at 30℃ but do not grow at 43℃, referred as temperature sensitive (TS) mutants, were further selected from the strains resistant to kaikosin E. I took advantage of the fact that TS phenotype correlates with mutations in essential genes. Usually, the mutations conferred are point mutations leading to change in an amino acid sequence of a protein, the stability of protein becomes dependent upon the temperature and the protein cannot function at higher temperatures but can still function at lower temperatures. This strategy helped to ignore other nonessential mutations that are less likely related to the target. I identified two TS strains resistant to kaikosin E. Analysis of these two TS strains revealed the presence of point mutations in fni (SA1236) and menA (SA0894) genes, respectively. Both of the genes are essential genes required for menaquinone biosynthesis, a key component of respiration in S. aureus (Figure 3). Since fni and menA genes were mutated independently in two strains, wild-type fni or menA were inserted in the respective strain, which complemented the TS phenotype in each strain suggesting that these two mutations were responsible for the TS phenotype of the mutants. Mutations in these two genes in kaikosin E resistant strains and involvement of these genes in the menaquinone biosynthetic pathway led to the speculation that menaquinone might be the target of kaikosin E. This was further evident from direct binding of kaikosin E to menaquinone (Figure 4). Furthermore, antimicrobial activity of kaikosin E attenuated upon addition of external menaquinone. The results unequivocally mentioned that menaquinone is the cellular target of kaikosin E. Since menaquinone does not exist in mammalian cells where its function is replaced by ubiquinone, the effect of addition of external ubiquinone on the antimicrobial activity of kaikosin E was tested. No change in the activity of kaikosin E upon addition of ubiquinone further provided the evidence for selectivity of kaikosin E towards microorganisms. This is the first report to reveal menaquinone as the target of any antimicrobial agents till date.

II. Compound 363

A novel antimicrobial agent, compound 363 was discovered from chemical library of about 100,000 compounds screened on the basis of therapeutic effect in silkworm infection model. To date, compound 363 is not known to have antimicrobial activity. It showed antibacterial activity against methicillin-susceptible S. aureus (MSSA) and MRSA with MIC value of 6.3 μg/ml and was bacteriostatic. It showed therapeutic activity in silkworm infection model with ED50 value of 39 μg/g・larva. It inhibited RNA synthesis in S. aureus (Figure 5). TS mutants resistant to compound 363 were obtained and their whole genome was sequenced by a next generation sequencer to identify mutated gene responsible for the resistance. The sigA gene encoding RNA polymerase sigma factor was found to have a point mutation among two of the resistant mutants. sigA is an essential gene responsible for initiation of transcription of house-keeping genes. The mutation in the sigA gene explained the result of inhibition on RNA synthesis in S. aureus by this compound. Phage transduction was performed to check if the mutation in sigA was responsible for resistance to compound 363. From the two resistant strains, 78% and 87% of the transductants were susceptible to compound 363, which is close to the calculated expected value of 85%. The whole genome sequence data suggested that no other gene close to sigA gene had mutations in both the strains. This, together with the phage transduction results, suggests that mutation in sigA gene is responsible for resistance conferred to compound 363.

Discussion

Based on the silkworm infection model, two novel therapeutically effective antimicrobial agents were identified. A novel strategy of TS screening was applied to find the target of kaikosin E as menaquinone. Lack of menaquinone in mammals explained its selective toxicity towards microorganisms and showed that kaikosin E has a great potential for clinical applications. This is the first report to reveal menaquinone as a target of an antibiotic. For compound 363, mutation in sigA gene was found to be responsible for resistance conferred to this compound suggesting that RNA polymerase sigma factor might be the target and involved in the mechanism of antibacterial action of compound 363. The mechanism found from this study can be further exploited to the screening, identification and design of novel therapeutically effective drug molecules ultimately providing novel insights for development of novel antimicrobial agents. These findings showed that silkworm infection model can be applied to identify novel therapeutically effective antimicrobial agents.

Figure 1

Figure 2

Figure 3

Figure 4

Figure 5

Mechanistic analysis of novel therapeutically effective antimicrobial agents identified using silkworm bacterial infection model (邦題:カイコ細菌感染モデルを用いて同定された治療効果を示す新規抗菌薬の機能解析)と題する本論文は、現在、臨床上問題となっている多剤耐性菌に有効な新規治療薬の探索法の確立を行い、及びそれによって得られた化合物の作用機序解析における研究の成果を論じたものである。多剤耐性菌に有効な新規治療薬の開発において、High Throughput Screening(HTS)等による試験管内での抗菌活性を指標とした従来の探索では、標的特異的な化合物を取得が困難であることが示されており、新規な手法による治療効果を示す抗菌薬の探索法の確立が重要とされている。また、得られた化合物の標的の同定は、より高い活性を有する抗菌化合物の創出、及び臨床における抗菌薬の位置づけを決定する際に重要となる。

本論文の主要な部分は三章から構成され、第一章ではカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルを利用した治療効果を示す新規抗菌薬の同定、及び抗菌特性について、第二章ではそれらの黄色ブドウ球菌における標的解析を含めた作用機序解析について、第三章では有機合成展開された2つの新規抗菌化合物の同定、及び黄色ブドウ球菌に対する作用を論じている。

論文のイントロダクションにおいては、これまでの抗菌薬開発における問題点が指摘され、治療効果を有する抗菌薬開発の重要性、及びそのためのアプローチとしてカイコ細菌感染モデルを用いた探索手法の確立の有用性が述べられている。

第一章の前半では、博士課程以前にカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルにおけり治療効果を指標とした探索において見いだしていた、土壌細菌が生産する新規抗生物質カイコシンについて、その構造解析の結果、リポペプチド系の新規構造を有する抗菌化合物であることを報告しいている。また、カイコシンの抗菌スペクトラムは多剤耐性菌を含む黄色ブドウ球菌やバチラス等のグラム陽性菌の一部に有効であること、及びマウスの黄色ブドウ球菌感染モデルにおいてバンコマイシンに比べても良好な治療効果を示すことを明らかにしている。さらに、カイコシンの黄色ブドウ球菌に対する作用は、膜障害性を伴う殺菌的作用であることを見いだした。後半では、カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルを利用した治療効果を指標とした探索により、化合物ライブラリーから3つの化合物が得られたことを報告し、最も治療成績が良かった化合物363について、抗菌スペクトラムが多剤耐性菌を含むグラム陽性細菌の一部の菌に有効であること、及び、マウスモデルにおいても治療効果を示すことを明らかにしている。さらに、黄色ブドウ球菌に対する作用として、RNA合成を阻害すること、及び静菌的効果を示すことを見いだしている。

第二章では、それぞれの化合物について作用メカニズムの解析を行っている。前半では、カイコシンEに対する薬剤耐性、温度感受性変異株を取得し、その温度感受性を示す変異遺伝子がメナキノン合成経路に存在することが示され、カイコシンEとメナキノンとの混合により沈殿が生じ、さらにカイコシンEの活性がメナキノンによって阻害されることが示された。従って、これらの結果から、カイコシンEの標的は細胞膜中のメナキノンであり、新規の抗菌活性発揮メカニズムであることが示唆された。また、メナキノンは細菌の呼吸基質として利用されるが、哺乳動物においてはユビキノンが利用され、メナキノンとは構造が異なるため、マウスモデルにおいて毒性を示さないのではないかと議論されている。後半では、化合物363についてその耐性株を取得し、遺伝子変異を次世代シークエンサーによって解析している。その結果、異なる二株の耐性変異株から共通してハウスキーピング遺伝子の転写因子であるsigB遺伝子に変異が認められている。遺伝学的な解析により、薬剤耐性との相関が示されており、sigB遺伝子の変異が化合物363に対する耐性遺伝子であると考えられ、化合物363がRNA合成を阻害する事象と矛盾しない。

第三章では、化合物ライブラリーより抗菌活性を指標として探索され、見いだされた2つの新規抗菌化合物について、構造と抗菌活性の相関について解析を行っている。前半では、deoxyribofuranosyl indole化合物について、後半ではimino-thaidiazolo- pyrimidinone化合物について解析を行っている。どちらの化合物においても、母核は同じにもかかわらず修飾によって、黄色ブドウ球菌に対する作用が殺菌的であったものが、静菌的なものに変化したりなどの、構造活性相関の結果が述べられている。

以上の研究によって、カイコ細菌感染モデルを用いた、天然物及び有機合成化合物のライブラリーからの探索によって、治療効果を有する2つの新規抗菌化合物が見いだされ、それらの作用メカニズムについて明らかにされた。従って、カイコ細菌感染モデルを利用した治療効果を指標とした抗菌治療薬の探索系の有用性が示されたと考えられる。さらに、得られた治療効果を有する2つの化合物の作用機序は、既存の抗菌薬にはない全く新しいものであると考えられることから、新しいクラスの抗菌剤としての臨床応用が期待される。細菌感染治療薬は、多剤耐性菌の出現によって既存の抗菌薬による治療が困難である症例が問題となっており、新しい作用メカニズムに基づく、新規構造の治療薬の開発が急務となっている。本研究の成果は、新規感染症治療薬開発において重要な貢献を果たしていることから、この研究を行ったアトミカパウデルは博士(薬学)の学位を与えるのに相応しいと判断した。