Endocytosis is defined as the uptake of membrane proteins, lipids, extracellular ligands and soluble molecules from cell surface/extracellular space into the cell interior by endocytic vesicles. This process is a vital process required for many cellular activities, including extracellular nutrient uptake, antigen uptake, membrane recycling and signal transduction. Eukaryotic cells are capable of different types of endocytosis ranging from receptor-mediated uptake of soluble ligands by clathrin-coated vesicles to ingestion of large particles by phagocytosis. Endocytosis occurs by multiple mechanisms that fall into two broad categories, "phagocytosis" (uptake of large particles) and "pinocytosis" (uptake of fluid and solutes). Phagocytosis is restricted to specialized mammalian cells, whereas pinocytosis occurs in all cells by at least four basic mechanisms: macropinocytosis, clathrin-dependent endocytosis, caveolin-dependent endocytosis and clathrin/caveolin-independent endocytosis.

Macropinocytosis is unique because, unlike other pinocytic processes, it is preceded by vigorous plasma membrane activity in the form of ruffling. Macropinocytosis can be classically defined as a transient, growth factor induced,actin-dependent endocytic process that leads to internalization of fluid and membrane into large vacuoles, called macropinosome, by the closure of lamellipodia generated at ruffling membrane domains. By its nature, macropinocytosis is thought to be used by cells for the non-selective internalization of fluid. However, recent studies have shown that, under special circumstances, macropinocytosis can facilitate the uptake of "particles" including bacteria and viruses for their infections. In the immune system, macropinocytosis is means by which antigen-presenting cells sample their immediate environment antigens. In the case of dendritic cells, immature dendritic cells utilize macropinocytosis to sample large quantities of exogenous solute from their immediate environment for circulating antigens as part of their sentinel function. Furthermore, in the aspect of therapeutics, macropinocytosis gains growing interests as a potential tool for delivery of nucleic acids, peptides and therapeutics into cells.

Considerable efforts have recently been made to elucidate the molecular mechanism underlying macropinocytosis. One of key differences between clathrin-dependent endocytosis and macropinocytosis is that the latter requires actin cytoskeleton reorganization. The remodeling of the cytoskeleton that leads to macropinocytosis requires phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) activity at the plasma membrane. Although the picture of macropinocytosis at molecular level is elusive, several molecules essential for macropinocytosis have been identified. The GTPase Rac1 and Cdc42, as well as p21-activated kinase-1 (PAK-1), are involved in the actin polymerization, and CtBP1/BARS is required for macropinosome closure. The activation of PI3K and the engagement of Rho family GTPase are common to a variety of actin-dependent processes such as phagocytosis and chemotaxis. Thus, treatment with inhibitors like wortmannin effectively blocks these processes, as well as macropinocytosis. In contrast, macropinosome formation appears to be uniquely susceptible to inhibition by amiloride and its analogues, and this property has been extensively used as an identifying feature of macropinocytosis. Amiloride, a guaniginium-containing pyrazine derivative, has been used as an inhibitor of Na+/H+ exchangers, and inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Also, recent studies have shown that SHIP2, PI(3,4,5)P3 5-phosphatase, and SNX5 were required for macropinocytosis.

Several studies utilized the worm C. elegans to examine endocytosis in a multicellular organism. A number of endocytosis assays have been developed to study the mechanisms of endocytosis and endocytic trafficking in C. elegans. Greenwald and Fares have established fluid phase endocytosis assays in C. elegans. Six scavenger cells, called coelomocytes, reside in the C. elegans body cavity and actively and continuously endocytose fluid and macromolecules from the body cavity. These cells of 10 ± 15 μm diameter have relatively fixed positions, and are not essential for the survival of the animal. Most foreign substances that are microinjected into the body cavity of C. elegans are rapidly taken up by coelomocytes. Though their biological role in C. elegans is currently unknown, the coelomocytes constitute an excellent tissue to study fluid-phase endocytosis. An in vivo assay for endocytosis by coelomocytes has been developed. The assay utilizes transgenic worms in which a secretory signal sequence-GFP chimera (myo-3p::ssGFP) is secreted into the pseudocoelom from body-wall muscle cells. The GFP is endocytosed primarily by the coelomocytes, and is subsequently degraded. Several groups revealed that some genes were required for fluid phase uptake in coelomocytes.

In the present study, we first hypothesized that macropinocytosis contributes, in part, to this fluid-phase endocytosis in C. elegans coelomocytes. We focused on mtm-6 and mtm-9, phosphoinositides 3-phophatases, previously reported that mutations of these genes caused defects in fluid phase endocytosis in coelomocytes and showed that coelomocytes of mtm-6 and mtm-9 mutants did not endocytose fluid-phase marker. We then showed that MTMR6 and MTMR9, mammalian homologues of mtm-6 and mtm-9, were essential for macropinocytosis, not for clathrin-dependent endocytosis in A431 cells. Furthermore, we showed that phosphoinositides 3-phosphatase activity of MTMR6 was required for macropinocytosis. We revealed that MTMR6 was involved not in membrane ruffle formation but in macropinosome formation in the process of macropinocytosis. These data indicate that MTMR6 and MTMR9 are novel regulators of macropinocytosis. Next, we focused on PIPs metabolism during macropinocytosis. We found that sequential conversion of PI(3,4,5)P3 to PI is essential for membrane closure of macopinocytosis and identified INPP4B, 4-phosphatase of PI(3,4)P2, as a novel molecule required for macropinocytosis. Finally, we found that pretreatment of TRAM-34, a specific inhibitor of Ca dependent potassium channel KCa3.1, caused defects in membrane closure of macropinocytosis. This channel is activated by PI3P and inactivated by MTMR6 through PI3P degradation. These data indicate that proper activation of KCa3.1 by PI3P and inactivation of KCa3.1 through PI3P degradation by MTMR6 is important for membrane closure of macropinocytosis.

エンドサイトーシスは細胞外の粒子、液相、リガンド、細胞膜タンパク質、細胞膜脂質を内在化する機構であり、細胞外液中の栄養素の取り込み、抗原の貪食、膜タンパク質の分解及びリサイクル、シグナル伝達等に関わる重要な細胞機能である。マクロピノサイトーシスはエンドサイトーシスの一つの様式であり、刺激依存的に細胞骨格の再構築と細胞膜の隆起を伴って、広い範囲の細胞外液及び細胞膜を細胞内に一度に取り込む特徴がある。近年、ウイルスやバクテリアなどの宿主への侵入や樹状細胞における抗原の取り込みなどに、マクロピノサイトーシスが利用されていることが明らかにざれ、その生理学的意義に注目が集まっている。しかしながら、マクロピノサイトーシスは非特異的な細胞外液の取り込み機構としてしか考えられてこなかったため、クラスリン依存的なエンドサイトーシスなどに代表される他の経路と比較して、分子機構の解明が大変遅れてきた。

本研究において、前川は線虫の細胞外液の取り込みを指標とした輸送アッセイ系に異常を示す遺伝子(mtm-6,mtm-9)に着目した。そして、動物細胞においてmtm-6,mtm-9の哺乳動物ホモログであるMTMR6,MTMR9のマクロピノサイトこシスへの関与を検証した結果、MTMR6とMTMR9がマクロピノサイトーシスの新規制御分子であることを見出した。Coelomocyte uptake(CUP)assayは、線虫の体壁筋から擬体腔へと放出されたGFPのcoelomocyteにおける取り込みを指標とした液相性のエンドサイトーシスの輸送アッセイ系である。これまでに、17遺伝子がその欠損により、CUP assayに異常を示すことが報告されている。前川は、CUPの一部をマクロピノサイトーシスが担っていると考え、CUPに異常を示す遺伝子に着目し、その哺乳動物ホモログがマクロピノサイトーシスに関与するかを検証した。まず、CUPに異常を示す遺伝子のうち、進化的に酵母からヒトまで保存されているPIPs(phosphoinositides)3-phosphataseである、mtm-6/MTMR6、mtm-9/MTMR9に着目した。mtm-6変異体、mtm-9変異体は、過去の報告の通りCUPに異常を示し、GFPが擬体腔に溜まる様子が観察された。また、摘出したntm-6変異体、mtm-9変異体のcoelomocyteは細胞外液中のデキストランを全く取り込めないことも分かった。以上の結果から、前川はmtm-6,mtm-9はcoelomocyteにおける液相の取り込みに必要であることを明らかにした。

次に、前川はmtm-6,ntm-9のそれぞれ唯一の哺乳動物ホモログであるMTMR6、MTMR9がマクロピノサイトーシスを制御しているか、ヒト扁平上皮癌由来のA431細胞を用いて検証した。A431細胞は、EGF刺激後数分の間に一過的なマクロピノサイトーシスを引き起こすことが知られている。蛍光標識されたデキストランの取り込み量をFACSにより定量したところ、EGF刺激によってその取り込みが増大し、マクロピソサイトーシスの阻害剤であるアミロライドによって顕著に抑制された。このマクロピノサイトーシスのFACSによるアッセイ系を用いて、MTMR6を発現抑制し、細胞のマクロピノサイトーシス能を測定した結果、マクロピノサイトーシスを制御している事が示されているアクチン重合促進因子PAK-1を発現抑制した時と同程度に、マクロピノサイトーシス能が顕著に減少していることを確認した。以上の結果から、MTMR6,MTMR9はマクロピノサイトーシスの新規制御分子であることが明らかになった。一方で、MTMR6,MTMR9をそれぞれ発現抑制しても、クラスリン依存的に細胞に取り込まれるトランスフェリンの取り込みの抑制は見られなかったことから、前川はMTMR6,MTMR9がマクロピノサイトーシスを特異的に制御している事を明らかにした。

マクロピノサイトーシスは、1)刺激依存的なアクチン重合とラッフル膜の形成、2)形成されたラッフル膜同士の融合によるマクロピノソームの形成の2つのステップで構成されている。そこで、前州はMTMR6がマクロピノサイトーシスの2つのステップのどちらで機能しているかを検討した。前者はファロイジン染色及び走査型電子顕微鏡観察により、後者は位相差顕微鏡による1ive cell imagingにより検証した。その結果、MTMR6発現抑制下でも、EGF刺激依存的なアクチン重合及び、細胞表面のラッフル膜の形成は正常であり、異常は見られなかったが、MTMR6を発現抑制した細胞では、細胞膜の隆起は起きるものの、その後のマクロピノソームの形成が殆ど起きていないことが分かった。コントロール細胞では、EGF刺激12.5分後にはマクロピノソームが透明度の高い小胞(白く観察される)として観察されたが、MTMR6を発現抑制した細胞では、このマクロピノソームの形成が全く見られなかった。以上の結果から、前川はMTMR6がマクロピノサイトーシスの過程において、刺激依存的なラッフル膜の形成後の膜の融合に関与していることが明らかにした。これまで、マクロピノサイトーシスにおけるラッフル膜の融合に関わる分子は殆ど同定されておらず、本研究は大変新規性の高いものである。

MTMR6はPI3PをPIに変換する酵素である。これまで、マクロピノサイトーシス時におけるPIPs動態について、ラッフル膜上で一過的にPI345P3、PI34P2が産生、消失されることが分かっており、その産生酵素も分かっている。前川は、このラッフル膜上で一過的に産生されるPI345P3が、PI34P2、PI3P、PIへと代謝されていく事がマクロピノサイトーシスのラッフル膜の融合に必要であるという仮説を立てた。これまでに、PI34P2をPI3Pに変換する酵素として、INPP4Bが同定されている。そこで、前川はINPP4Bがマクロピノサイトーシスの制御分子かどうかを発現抑制実験により検証した。その結果、MTMR6,MTMR9と同様に、INPP4Bを発現抑制することでマクロピノサイトーシスが顕著に抑制されることが明らかになった。また、その作用点もMTMR6と同様に、ラッフル膜の形成ではなく、その後のラッフル膜の融合過程であることを明らかにした。さらに、クラスリン依存的なトランスフェリンの取り込みには異常が無いことも確認している。以上の結果から、前川はINPP4Bもマクロピノサイトーシスの新規制御分子である事を明らかにした。さらに、INPP4B、MTMR6の発現抑制下で、EGF刺激10分後において、ラッフル膜にPI34P2、PI3Pが蓄積していることも明らかにしている。

最後に、前川は近年、MTMR6が負に制御していると報告されたKCa3.1に着目した。KCa3.1はCa依存性のKチャネルであり、PI3Pによって活性化することが知られている。前川はマクロピノサイトーシス時において、ラッフル膜上で一過的に産生、消失するPI3Pによる、このチャネルの不活性化がマクロピノサイトーシスのラッフル膜の正常な融合に必要であると考えた。そこで、前川はKCa3.1の特異的な阻害剤であるTRAM-34を処理した所、マクロピノサイトーシスが特異的に抑制され、ラッフル膜の融合に異常が生じることを明らかにした。以上の結果から、KCa3.1がPI3Pのエフェクターとしてマクロピノサイトーシス時において機能していることが明らかにされた。

本研究では、線虫でのcoelomocyteにおけるエンドサイトーシス異常(CUP異常)という現象を哺乳動物細胞のマクロピノサイトーシスに応用し、その結果マクロピノサイトーシスを特異的に制御する新規分子としてMTMR6,MTMR9を同定した。この結果は、線虫のCUPassayが哺乳動物細胞におけるマクロピノサイトーシスを解析する為の強力な遺伝学的ツールになり得ることを示すものである。今後、網羅的RNAiスクリーニングによる新規cuP遺伝子の同定や、mtm-6変異体、mtm-9変異体のcuP異常のサプレッサー遺伝子の同定等により、哺乳動物細胞におけるマクロピノサイトーシスを制御する分子基盤の更なる解明が期待される。また、MTMR6,MTMR9,KCa3.1のノックアウトマウスの解析などを通して、マクロピノサイトーシスの生理学的及び、病理学的意義が明らかになることが期待される。本研究は、ウィルスやバクテリアの侵入機構や、樹状細胞での抗原の取り込み機構として着目されているマクロピノサイトーシスの制御分子を多数同定したという点で、大変意義深く、博士(薬学)に充分値するものと判断した。