【序】

神経細胞は高度に極性化した細胞突起(軸索・樹状突起)を有し、それらを適切に配線することによって複雑な神経回路網を作りだしている。神経突起の形態形成を正確に行うために、神経突起は周囲の環境を正しく認識し、突起内で時空間特異的に適切な分子を運ぶ必要がある。この過程において、エンドサイトーシスとその後のエンドソームの成熟、および輸送が非常に大きな役割を果たしている。例えば、伸長中の軸索突起先端において、細胞膜表面分子(接着分子やガイダンスレセプター)の量がエンドサイトーシス経路よって調節され、それにより軸索が正しい標的へと到達する。エンドソームの成熟に関して、培養細胞や初代培養系では研究が進み多くの分子の関与が明らかになっているが、生体内での生理的意義は殆ど解明されていない。本研究では、ショウジョウバエ嗅覚系神経回路を用いて脳内における初期エンドソームの成熟が軸索伸長に重要であることを示し、更にこの過程を制御する進化的に保存された新規分子Dogi を同定し、その機能解析を行った。

【方法と結果】

1. dogi 変異神経は軸索伸長と樹状突起の枝分かれに異常を示す

ショウジョウバエ遺伝学的モザイク解析法:MARCM 法は、脳内で単一神経細胞のみを可視化し、且つ目的の遺伝子ホモ変異接合体にすることを可能にする(図1a,b)。 私は本学修士課程においてこのMARCM 法を用いて、dogi(6-40) 変異ホモ接合体 投射神経(dogi(6-40) PN)の表現型解析を行った。dogi6-40 PN では、軸索が野生型に比べて顕著に短くなっていた。野生型軸索が側角でL 字型の枝分かれをする(図1c)のに対し、dogi(6-40) PN 軸索は側角の先端まで伸長しなかった(図1e)。更に樹状突起においても野生型PN が決まった一つの糸球体に投射する(図1d, d')のに比べ、dogi(6-40) PN では樹状突起の枝分かれ回数が一回増加し(f'、矢頭)、2つの糸球体に投射していた(図1f, f')。

2. Dogi はGlued と結合し、遺伝学的にも相互作用する

dogi(6-40) 変異体の原因遺伝子dogi は酵母からヒトまで進化的に保存された蛋白質Dogi をコードしている。Dogi は、既知の機能ドメインを有しておらず、その機能は未知である。私はDogi の機能解析を行う目的で、酵母ツーハイブリッド法を用い、Dogi が相互作用する候補分子として、微小管輸送において重要な役割を果たすGlued (Gl, ヒトp150(Glued) のホモログ)を単離した。ショウジョウバエ胚のライセートを用いた免疫共沈降実験により、内在性Dogi が内在性Gl と結合することを確認した。また、dogi(6-40),Gl の二重変異神経において、dogi(6-40) PN で観察された軸索伸長と樹状突起の枝分かれ異常が相乗的に増悪した(図1g, h,h')。以上より、Dogi とGl は生化学的にも遺伝学的にも相互作用することが明らかとなった。

3. 発生中のdogi 変異神経において初期エンドソームの局在に異常が生じた

Gl は微小管逆行輸送のモーター蛋白質 Dynein を制御するDynactin 複合体の主要構成因子である。そこで、Dogi も微小管輸送に関与し、発生中の神経突起において形態形成に必要な分子を輸送することで軸索伸長と樹状突起の枝分かれを制御すると仮定した。軸索伸長が起きている蛹期の投射神経において、Dynein/Dynactin によって微小管上を輸送される初期エンドソームの局在を観察したところ、野生型(図2a)に比べ、dogi(6-40) PN では軸索束に局在する初期エンドソームの量が顕著に増加していることが判明した(図2b,c)。

4. Dogi ノックダウン細胞において初期エンドソームの成熟に異常が生じる

Dogi がどのように初期エンドソームの輸送に関与しているかを解明するために、ショウジョウバエS2 細胞において、初期エンドソームの局在を調べた。興味深いことに、Dogiノックダウン細胞において、初期エンドソームマーカーの一つであるAvalanche(Avl,Syntaxin 7 のホモログ)の免疫組織化学が減少し、コントロール細胞(図3a,c)で観察されたAvl の核周辺への蓄積が観察されなかった(図3b,c)。FM1-43色素を用いて、コントロール細胞とDogiノックダウン細胞でエンドサイトーシスアッセイを行ったところ、いずれの細胞においてもエンドサイトーシスは確認された。しかし、FM1-43 色素を加えた40 分後には、コントロール細胞でFM1-43 色素の蓄積(図3d,f)が見られる一方、Dogi ノックダウン細胞ではFM1-43 色素の蓄積は観察されなかった(図3e,f)。またヒトDogi をノックダウンしたHeLa 細胞においてEGF-Alexa488 の取り込み実験を行った際も核近傍におけるEGF-Alexa488 の蓄積が観察されなかった。

5. Dogi はRab5と協調的に初期エンドソームの成熟に関わることで軸索伸長を制御する

初期エンドソームは融合を繰り返し、より大きな初期エンドソームへと成熟する。低分子量G 蛋白質のRab5 とそのエフェクター分子群は、エンドサイトーシスと初期エンドソームの成熟に関与することが知られている。Rab52 PN はdogi(6-40) PN と同様に、軸索伸長と樹状突起の枝分かれに異常を示した。そこで、dogi(6-40) PN に恒常活性化型Rab5 もしくは機能欠損型Rab5を強制発現したところ、恒常活性化型Rab5 を発現したdogi(6-40) PN では、軸索伸長の異常が改善され(図4c, e)、機能欠損型Rab5 を発現したdogi(6-40) PN では、異常が顕著に亢進した(図4d, e)。また、ショウジョウバエ胚ライセートを用いた免疫共沈降実験により、内在性Dogi が内在性Rab5 と複合体を形成することを確認した。以上の結果から、Dogi はRab5 と協調的に働き、微小管上の初期エンドソームの成熟に関わることにより、PN の軸索伸長を制御していることが明らかとなった。

【まとめと考察】

本研究ではショウジョウバエ嗅覚系投射神経(PN)において、新規分子Dogi が初期エンドソームの成熟に関わることにより、軸索伸長を制御していることを明らかにした。本研究で新しく同定したDogi は、Dynein モーターの調節を担うDynactin 複合体の主要構成因子であるGlued と結合する。更に、初期エンドソームの成熟を担うRab5 とも複合体を形成する。これまで初期エンドソームの融合を担うRab5 と、初期エンドソームの輸送を行うDynein、Glued の働きはそれぞれ明らかにされていたが、両者を結び付ける研究はなされていなかった。今回、この両者と複合体を形成する新規蛋白質Dogi を見出し、Dogi がエンドサイトーシス直後の未成熟な初期エンドソームの輸送をDynein、Glued と共に調整することで、Rab5 およびそのエフェクター蛋白質による「未成熟初期エンドソームの融合」を促進していることを示した。このようなDogi の働きにより、初期エンドソームの成熟は円滑に進められる。成熟した初期エンドソームは、エンドサイトーシスされた分子が分解されるか、膜表面へとリサイクルされるかの運命決定を行う重要な細胞内小器官であり、加えて細胞の生存や増殖に関わる種々のシグナル経路を活性化させる働きも行う。そのため、初期エンドソーム自身の形成・成熟は細胞にとって重要な過程と考えられているが、その生体内での役割はそれほど解明されていなかった。よって本研究は、脳内での軸索伸長過程に初期エンドソームの成熟が重要であることを示した初めての報告であり、神経回路形成におけるエンドソームの役割について新たな洞察を与えたと言える。また、初期エンドソームの成熟は神経以外の細胞でも広く起きる現象であるため、様々な細胞におけるエンドサイトーシス経路の役割の理解にもDogi の研究は新たな洞察を与えることが期待される。

Dogi は進化的に高度に構造が保存されている蛋白質である。dogi(6-40) PN にマウスオルソログのcDNA を強制発現しレスキュー実験を行ったところ、軸索伸長および樹状突起の枝分かれ異常が回復した。このことより、Dogi の機能も種間で保存されていることが予想された。哺乳類神経発生におけるDogi の機能を調べる目的で、子宮内電気穿孔法を用い、マウス大脳皮質の錐体神経においてDogi をノックダウンしたところ、錐体神経の移動に異常が生じた。既に錐体神経の大脳皮質における移動には、Rab5, 7, 11 などによる、N-cadherin のトラッフィッキングが重要であることが報告されているため、マウスにおいてDogi はRab5 と協調的に錐体神経の移動を調節していることが推察される。

またDogi の結合相手のGlued のヒトオルソログp150(Glued) は、神経変性疾患の原因遺伝子である。代表的な変異は、p150(Glued) の微小管結合ドメインであるCAP-Gly ドメイン内に生じている。微小管逆行輸送は軸索突起先端の置かれている状況を細胞体に伝える役割があり、この情報に応じて神経は不適切な環境にある軸索を変性させたり、生存シグナルを活性化させたりする。逆行性輸送に異常が生じると、突起の情報が伝わらないため、軸索の変性が始まると考えられている。Dogi が Glued やRab5 と共に、軸索伸長に必要なシグナルを逆行性輸送によって伝えていること、およびDogi が神経回路形成終了後の神経にも発現していることから、Dogi が軸索変性に積極的に関与する可能性も考えられる。以上より、今後、Dogi 機能の理解を更に深めることは、神経発生のみならず病理学的にも新たな洞察を与える可能性を秘めている。

図1a:ショウジョウバエ頭部(左)と嗅覚系投射神経(PN,右)の模式図

b:可視化された単一PN c:野生型PN軸索、側角に投射する

d:野生型PN樹状突起、単一糸球体に投射する。d'はdの拡大図。

e:dogiPN軸索、短くなる f:dogiPN樹状突起、2つの糸球体に投射

g-h':dogi,GI二重蛮異PNの軸索と樹状突起、dogiPNの異常が亢進。

図2:初期エンドソームマーカーGFP-FYVEのPN軸索束における局在(蛹期)。

GFP-FYVEを発現するdogiPNの軸索束(b)では、GFP-FYVEを発現する野生型(a)に比べ、GFP-FYVEがより多く局在している。スケールバー:10μm(c)軸索束200μm2におけるGFP-FYVEの輝度を、軸索をラベルしているmCD8RFPの輝度で基準化し、プロットした。**p=0.0066,t検定。

図3:(a-b)ショウジョウバエS2細胞における初期エンドソームマーカーAvlの局在。

dogi dsRNA処理をした細胞(b)では、Avlの集積(a,矢頭)が観察されなかった。(c)Avlの集積度合いに応じて、細胞を3クラスに分類し、割合を示した。***p<0.0001,X二乗検定。(d-f)FM1-43色素を用いたエンドサイトーシスアッセイ。dogi dsRNA処理をした細胞では、色素の集積(d,矢頭)が観察されず、小さなエンドソームの数が多かった。スケールバー:7.5μm、(f)***pく0.OOO1,Kruskal-Wallis検定。

図4:dogiとRab5の遺伝学的相互作用。恒常活性化型Rab5を発現したdogiPNにおいて、軸索の伸長異常は抑制され、側角の先端まで軸索が伸長した(c)。一方、機能抑制型Rab5を兜現したdogiPNでは、軸索の伸長異常が亢進し、dogiPN(b)より短くなった(d)。スケールバー:25μm(e)軸索の伸長度合いによって、全てのPNを5つのクラスに分類した*p=0,011,***p<O,OOO1、X二乗検定。

神経細胞は高度に極性化した細胞突起(軸索・樹状突起)を有し、それらを適切に配線することによって機能的な神経回路を構築し、記憶や学習、全身の統合を司る。近年.神経の形態形成におけるエンドソームの重要性が注目されている。神経突起は周囲の環境を適切に認識し、突起内で時空間特異的に適切な分子を運ぶ必要があり、この過程にエンドサイトーシスとその後のエンドソームの成熟、および輸送が非常に大きな役割を果たしていることが示されている。しかし、エンドソームの成熟・輸送に関して、培養細胞や初代培養系では研究が進み多くの分子の関与が明らかになっているが、生体内での生理的意義は殆ど解明されていない。そこで本研究は、ショウジョウバエ嗅覚系神経回路を用いて脳内における初期エンドソームの成熟が軸索伸長に重要であることを示し、更にこの過程を制御する進化的に保存された新規分子Dogiを同定し、その機能解析を行った点で重要である。

申請者の所属研究室の先行研究によって、神経形態に影響を与える変異体として単離されたものの一つにdogi変異体がある。この変異体の表現型解析を行うために、軸索並びに樹状突起形態の定性・定量的な解析が容易であるショウジョウバエ嗅覚系投射神経(PN)を用いた。PNにおいて脳内単一モザイク解析法(MARCM法)を用いることで単一PNを可視化及び遺伝子操作し、dogi変異ホモ接合体投射神経(dogi PN)の表現型解析を行ったところ、軸索は野生型に比べて顕著に短くなり、樹状突起の枝分かれが増加していた。

これら表現型の原因遺伝子を遺伝学的マッピングにより同定したところ新規の遺伝子であったため、dog遺伝子と名付けた。dogi遺伝子のコードするDogi蛋白質は酵母からヒトまで高度に保存されているが、既知の機能ドメインを持たない。そこでDogiの機能解析を行う目的で酵母ツーハイブリッド法を用い、Dogiが相互作用する候補分子として微小管逆行性輸送を調節するGlued(Gl,ヒトp150(Glued)のホモログ)を単離した。ショウジョウバエ胚ライセートを用いた免疫共沈降実験より内在性DogiとGlの結合を確認した。また、dogi,Glの二重変異PNにおいて、それぞれ単独変異PNより軸索伸長と樹状突起の枝分かれ異常が相乗的に増悪することを観察した。以上より、DogiとGlは生化学的にも遺伝学的にも相互作用することが判明し、DogiもGlと同様、微小管輸送に関与する可能性が示唆された。

脊椎動物の培養細胞の系において、軸索におけるエンドサイトーシスおよびエンドソームの逆行性輸送が軸索の伸長・生存に必要であることが既に示されていたため、Dogiがエンドソームの輸送に影響を与えることで軸索伸長を制御すると仮定した。まず、dogiPNにおいて初期エンドソームマーカーのGFP-FYVEを発現し観察したところ、野生型PNではGFP-FYVEが軸索突起先端に多く局在するのに対し、dogiPNでは軸索束に多く局在する様子が観察された。以上より、Dogiが初期エンドソームの輸送に関与することが予想された。

更にDogiがどのように初期エンドソームの輸送に関与しているかを解明するために、ショウジョウバエS2細胞を用いて初期エンドソームの局在を調べた。コントロール細胞では初期エンドソームマーカーの一つであるAvalanche(Avl)が核周辺に集積しているのに対し、Dogiノックダウン細胞ではAvlの集積が観察されず、Avlの免疫組織化学染色も減少していた。この結果より、Dogiはエンドサイトーシスに影響を与える可能性が考えられた。この可能性を検証するため、細胞膜に挿入された際にのみ蛍光を発するFM1-43色素の取り込み実験を行ったところ、コントロール、Dogiノックダウン細胞のいずれにおいてもFM1-43色素の細胞内への取り込みが観察された。以上より、Dogiノックダウン細胞においてエンドサイトーシスは起きるが、初期エンドソームが核周辺へと集積し融合する過程「初期エンドソームの成熟」に異常が生じたと考えられる。同様の初期エンドソーム成熟の異常は、ヒトDogiをノックダウンしたHeLa細胞においてEGF-Alexa488の取り込み実験を行った際も観察された。

初期エンドソームの成熟に関与する分子として低分子量G蛋白質のRab5が広く知られている。そこで、MARCM法を用いてRabsPNを作成したところdogiPNと同様の軸索伸長と樹状突起の枝分かれ異常が観察された。更にdogiPNに恒常活性化型Rab5を強制発現したところdogiPNの軸索伸長異常が顕著に抑制された。一方、dogiPNに機能欠損型Rab5を強制発現したところdogiPNの軸索伸長異常が顕著に増悪した。また、ショウジョウバエ胚ライセートを用いた免疫共沈降実験より、内在性DogiとRab5が複合体を形成することも明らかにした。以上の結果からDogiはRab5と協調的に働き、微小管上の初期エンドソームの成熟に関わることで、PNの軸索伸長を制御していることを示した。

本研究ではショウジョウバエ嗅覚系PNにおいて、新規分子Dogiが初期エンドソームの成熟に関与することにより軸索伸長を制御していることを明らかにした。成熟した初期エンドソームはエンドサイトーシスされた分子が分解されるか、膜表面へとリサイクルされるかの運命決定を担う重要な細胞内小器官であり、加えて細胞の生存や増殖に関わる種々のシグナル経路の調節も行う。そのため、初期エンドソームの形成・成熟は細胞にとって重要な過程と考えられているが、その生体内での働きは殆ど解明されていなかった。本研究は脳内での軸索伸長過程に初期エンドソームの成熟が重要であることを示した初めての報告であり、神経回路形成におけるエンドソームの役割について新たな洞察を与えたと言える。また、初期エンドソームの成熟は神経以外の細胞でも広く起きる現象であるため、様々な細胞におけるエンドサイトーシス経路の理解にもDogiの研究は新たな洞察を与えることが期待される。

またDogiの結合相手であるGlのヒトオルソログp150(Glued)は、神経変性疾患の原因遺伝子であり、代表的な変異はp150(Glued)の微小管結合ドメインに生じている。微小管逆行性輸送は軸索突起先端の置かれている状況を細胞体に伝える役割がある。DogiがGlやRab5と共に、軸索伸長に必要なシグナルを逆行性輸送で伝達していること、およびDogiが神経回路形成終了後の神経にも発現していることから、Dogiが軸索変性に積極的に関与する可能性も考えられる。よって、本研究で同定された新規蛋白質Dogiの機能の理解を更に深めることは神経発生のみならず病理学的にも新たな洞察を与える可能性を秘めている。

以上より、本研究は博士(薬学)の学位に値すると判定した。