Introduction

Polytheonamide B (1) is a naturally occurring 48-mer peptide, and exhibits extraordinary potent cytotoxicity against P388 mouse leukemia cells (IC(50) = 0.098 nM).1 Peptide 1 possesses D,L-alternating amino acid sequence consisting of various non-proteinogenic amino acid components (Figure 1), and is known to fold into a β(6.3)-helical conformation in organic solvent (Figure 2a).2 Interestingly, peptide 1 forms a monovalent-cation selective transmembrane channel in phospholipid bilayers presumably by adopting the β(6.3)-helical structure.3 These unusual features of 1 prompted our group to conduct the total synthesis of 14 and functional analyses of the congeners.5 The purpose of this research is construction of a more synthetically accessible and more versatile platform to systematically investigate ion channel functions and cytotoxic activities. Herein design, synthesis and functional characterization of dansylated polytheonamide mimic (2) were described.6 Further structure-function analyses of 2 resulted in discovery of a non-channel forming 37-mer cytotoxin 24.7

1. Dansylated Polytheonamide Mimic 2 Formed Ion Channels in Phospholipid Bilayers

The total synthesis of 1 has been achieved in 161 total steps. However, the length of the route to 1 limited its supply to perform further studies on molecular functions. To reduce the significant number of synthetic steps, multiple substitutions of the component monomers were planned (Figure 2b). In doing so, the hydrogen bond donors/acceptors in the side chains of 1 were maintained, because the β(6.3)-helix of 1 is considered to be stabilized by hydrogen bonds not only of the main chain, but also of the side chains. The side chain of 13 was protected with 2,4,6-trimethoxybenzyl (Tmb) group to prevent interresidue hydrogen bondings of CONHMe groups in solid-phase peptide synthesis (SPPS), because interresidue hydrogen bondings could result in the formation of nonreactive aggregates in the peptide-resin matrix. In addition, 11 was adopted as a monomer of residue 44, because its terminal alkyne enables facile introductions of various functionalities by 1,3-dipolar cyclization (click reaction) with azide compounds. In this study, polarity-dependent dansyl fluorescent group was incorporated as a reporter of localization of 2 in a phospholipid bilayer.

As expected, the Tmb-protection significantly increased the efficiency of SPPS (Scheme 1). Namely, the 37-mer fragment 18 was synthesized from 2-chloro trityl resin 17. The introduction of dansyl functionality was attained using 19 with CuI, giving rise to coupling precursor 20. Optimized Ag+-mediated fragment coupling of amine 20 and thioester 16 afforded 21. Finally, simultaneous removal of 15 protective groups from 21 was achieved with the treatment of TFA/H2O. The synthetic strategy to 2 required significantly less synthetic steps in comparison to original 1 (127 steps vs 161 steps) and less technically demanding liquid-phase reactions of the large peptides, demonstrating highly operational superiority of this novel synthetic strategy to construct the 48-mer D,L-alternating sequence.

Interaction between 2 and lipid bilayers was evaluated from solvatochromism of 2 in liposomes. Peptide 2 in liposomes exhibited its Stokes shift as 10564 cm(-1). The value was comparable to that of MeOH (10130 cm(-1)), indicating that C-terminus of 2 is considered to be located to the lipid/water interface.

Formation of ion channels of 2 was evaluated by its single channel currents. In neutral solution (pH 7.4), Na+ current of 2 was comparable to that of 1 (Figure 3a). Thus, it was proved 2 emulated the channel function of 1. Intriguingly, H+ current of 2 in acidic solution (pH 1) was remarkably lower than that of 1 (Figure 3b). Since the dansyl group would be located in lipid/water interface, the difference of conductance values can be attributed to protonation of the dansyl group. Namely, the cationic group near the entrance of channel pore is considered to suppress cation flux by its binding to the entrance of the pore or by inducing a repulsive electrostatic effect.5 These results suggested a possibility of control of channel functions through pH modulation.

2. Truncated Analog 24 Behaved as a More Potent Cytotoxin than 2 and Exhibited No Ion Transport Activity

In characterization of mimic 2, IC50 value of P388 growth inhibitory activity of 2 was found to be 12 nM (Table 1). This value was still low as a cytotoxic agent, though its cytotoxicity was 100-fold lower than that of 1. The author next planned to perform comprehensive structure-activity relationship study of the substructures of 2.

Syntheses and cytotoxicity assay of the 13 truncated analogs 22–34 revealed that analog 24 specifically exhibited a more potent cytotoxicity (IC50 = 3.7 nM) than that of 2. Surprisingly, truncated 24 exhibited no ion transportation in liposomes (Figure 4) and in P388 cell membranes. These results suggested a possibility that analog 24 exerted its toxicity through a mode of action distinct from those of 1 and 2.

Conclusion

This work demonstrated that the newly designed synthetic strategy was highly effective to construct the 48-mer D,L-alternating sequence of 2. The various functional characterizations demonstrated that rationally designed peptide 2 successfully mimicked the channel function of 1. In addition, truncated 24 was found to have potent cytotoxicity and showed the different behaviors from the parent 1 and 2. Overall, the newly designed artificial sequence has a potential to be a novel structural platform for designing new peptide ion channels and unique cytotoxic compounds with desired activities.

Figure 1. Structures of polytheonamide B (1) and dansylated polytheonamide mimic (2).

Figure 2. (a) The β(6.3)-helix structure of 1 (PDB1D code 2RQO). The structures are rotated by 90-degree around the y-axis. The side chains that potentially participate in a hydrogen bonding network along the helix axis are shown with residue numbers. (b) Substituted component monomers in the synthesis of 2. The numbers indicated in parentheses are residue numbers. The numbers of synthetic steps are shown under the corresponding structures.

Scheme 1. Synthesis of dansylated polytheonamide mimic (2).

Figure 3. Current-voltage curves of 1 and 2. Currents show cation flows through DPhPC planer bilayers in (a) 1 M NaCl (pH 7.4) or (b) 0.1 M HCl (pH 1) containing channels formed by 1 and 2. DPhPC = diphytanoylphosphatidyl choline.

Table 1. Cytotoxic activities of synthesized peptides against P388 mouse leukemia cells

Figure 4. Time-course of H+/Na+ exchange across lipid bilayers of liposomes caused by 1, 2 and 24. Peptides were added at 60s.

伊藤寛晃は、「ポリセオナミドミミックの合成・構造改変・機能解析」のタイトルで、以下の研究を展開した。

ポリセオナミドB(1)は、48残基からなる巨大ペプチド天然物であり(Figure 1)、P388マウス白血病細胞に対して非常に強力な毒性を有する(IC(50)=O.098nM)。1の一次構造は、多数の非タンパク質構成アミノ酸を有し、D体、L体のアミノ酸が交互に配列する特異なものである。また、特定の有機溶媒中でβ(6.3)ヘリックス構造を形成し(Figure 2a)、脂質二重膜中、一価カチオン選択的なチャネルを形成することが知られている。当研究室ではこれまでに、この特徴的な構造と機能を有する1の全合成と、その誘導体の機能解析を達成している。伊藤は、容易に合成可能であり、加えて機能解析に有用な官能基を簡便に導入可能な人エイオンチャネル形成分子の創出を目的として研究に着手した。本研究で伊藤は、ダンシルポリセオナミドミミック(2)の合成と機能解析を行い、2が1と同様のイオンチャネルを形成し、強い細胞毒性を有することを明らかにした。さらに、2の構造機能相関研究を行うことで、非イオンチャネル型の強力な新規細胞毒性分子である24を見出した。

ペプチド1の全合成は、アミノ酸合成、自動固相合成、カップリング反応、脱保護の4段階を経て達成された。しかし、総工程数は161であり、詳細な分子機能解析に十分な量の1を得ることは困難であった。そこで伊藤は、合成工程数を削減するため、多数の合成工程を要するアミノ酸を、市販もしくはより短工程で合成可能なアミノ酸に置換した(Figure 2b)。ポリセオナミドのイオンチャネル機能発現に必須と考えられるβ6'3ヘリックス構造は、主鎖・側鎖の水素結合形成により安定化されると予想されている。そこで、置換に際しては、水素結合ドナー・アクセプターとなりうる側鎖官能基の多くを保存した。一方、側鎖の水素結合可能な官能基は、固相合成中に水素結合を形成し、低収率の原因になりうる。したがって、13の側鎖メチルアミド基には、新たにTmb基を導入し、固相合成収率の改善を図った。加えて、側鎖にアルキンを有する11を第44残基モノマー一として採用した。これにより、クリックケミストリーを用いて種々のアジド化合物を容易に側鎖に導入可能である。本研究で伊藤は、2と脂質二重膜の相互作用に関する情報を得るため、環境応答性の蛍光官能基であるダンシル基を導入した。

Tmb基を用いた戦略によって、固相合成収率は劇的に改善した(Scheme 1)。これにより、37残基からなるフラグメント18が、自動固相合成のみで調製可能になった。さらに、18に対して化合物19とヨウ化銅を作用させ、アミン20を合成した。続いて、最適化された条件を用いて、硝酸銀によりチオエステル16を活性化し、アミン20と縮合することで保護体21を得た。最後に、3種類、計15個の保護基を、TFAを用いて一挙に除去することで、2の合成を達成した。総工程数は127であり、1の161工程と比較して大幅な合成工程数の削減を実現した。また、1回のカップリング反応のみで48残基からなる全体構造を構築可能であり、技術的に困難な3回のカップリング反応を要する1と比較して、合成が高度に自動化されている点も重要である。

続いて伊藤は、合成した2の機能解析を行った。まず、2と脂質二重膜の相互作用に関する情報を得るため、リボソーム中における2のダンシル基由来のストークスシフト値を測定した。リボソーム中の2のストークスシフト値は10564cm(-1)であり、メタノール中とバッファー中における値の中間に相当した。この結果は、リボソーム中の2のダンシル基が脂質と水の境界領域に存在することを示唆した。

さらに彼は、2がイオンチャネルを形成するか調べるため、単一チャネル電流測定を行った。pH7.4の中性条件下、2の形成するチャネル電流値は、1のそれとほぼ同等であった(Figure3a)。これより、2は脂質二重膜中、1と同様にイオンチャネルを形成することが明らかになった。一方、pHlの酸性条件下においては、2の形成するチャネル由来の電流値は、1と比較して優位に低下していた(Figure 3b)。この結果は、ダンシル基が、脂質膜と水の境界領域に存在することを踏まえ、pHlではダンシル基がプロトン化されており、静電反発あるいは、ダンシル基のチャネル入ロへの接近によるイオン流動の阻害によって引き起こされると考察できる。これらの結果は、2の分子構造を有するpH感受性新規チャネル分子が創出可能であることを示唆した。

ミミック2の機能解析において、P388マウス白血病細胞に対する2の成長阻害活性はIC(50)=12nMであった(Table 1)。この値は、強力な毒性に該当するものの、天然物1と比較すると、2の毒性がおよそ1/100に減弱していた。そこで伊藤は、2の毒性発現のための最小構造要因を特定することを当初の目的として、網羅的な構造機能相関研究を計画した。13種類のN末端欠損体である化合物22-34を合成し、それらの細胞毒性を評価した。すると、37残基からなる化合物24が、特異的に強力な細胞毒性を有することが明らかになった(IC(50)=3.7nM)。さらなる機能解析の結果、24はリボソーム中においても(Figure 4)、P388の細胞膜中においてもイオン輸送能を持たないことが分かった。これらの結果は、化合物24の細胞毒性が、イオンチャネルを形成する1や2と異なった作用機序によって引き起こされる可能性を示唆した。

以上の研究において伊藤は、合理的に設計・合成された2の分子構造が、1の機能を模倣することを明らかにした。加えて、2の部分構造である化合物24が、親化合物である1や2と異なり、非イオンチャネル型の強力な細胞毒性分子として作用することを見出した。本研究によって、2の構造が、新規イオンチャネル分子や細胞毒性分子創出のための新たな分子基盤として有用であることが初めて示された。

この成果は、薬学研究に寄与するところ大であり、博士(薬学)の学位を授与するに値するものと認めた。