[Introduction]

The 26S proteasome catalyzes degradation of ubiquitinated proteins in eukaryotic cells, thus playing a central role in various cellular processes including cell cycle, transcription, signal transduction, immunity, and protein quality control.

The 26S proteasome has a highly complicated structure and is composed of the catalytic 20S core particle (CP) and the 19S regulatory particle (RP), which are assembled from 14 and 19 different subunits, respectively (Figure 1). The standard CP (sCP) consists of 7 different α-type subunits α1- α7 and 7 different β-type subunits β1- β7, of which β1, β2 and β5 are catalytically active. In vertebrates, two other subtypes of the CP exist. One is the "immunoproteasome (iCP)," in which the catalytic β1, β2 and β5 of the sCP are replaced by another set of catalytic subunits named β1i, β2i and β5i. This iCP efficiently generates antigenic peptides presented on MHC class I molecules. The other is the "thymoproteasome (tCP)," in which β5i of the iCP is replaced by β5t, which is exclusively expressed in cortical thymic epithelial cells. This tCP plays a pivotal role in positive selection of CD8+ T cells. The RP can be divided into a base and a lid subcomplex. The base, which is required for recruiting ubiquitinated proteins and unfolding them, comprises 6 ATPase subunit Rpt1-Rpt6 and four non-ATPase subunit Rpn1, 2, 10 and 13, whereas the lid, which is essential for removing ubiquitin chains from the substrates, comprises 9 non-ATPase subunits Rpn3, 5-9, 11, 12, and 15.

Accurate assembly of the proteasome from the 33 different subunits is a prerequisite for degradation of ubiquitinated proteins. Recent studies have revealed that biogenesis of the sCP and the base subcomplex were assisted by multiple dedicated chaperones. However, little is known about the assembly pathway of the iCP, tCP, and the lid subcomplex. In this study, we investigated the biogenesis of the two specialized types of CPs and the lid subcomplex using combination of RNA interference (RNAi) and mass spectrometry in mammalian cells.

[Results]

1. Dissecting assembly pathways of the 20S immunoproteasome (iCP) and the 20S thymoproteasome (tCP)

1-1. Earlier incorporation of the specialized β-subunits than the standard β-subunits

Making use of HeLa cells treated with IFN-γ and the stable expression of β5t in HEK293T cells, we described a series of biochemical experiments employing RNAi of each β subunit, which resulted in accumulation of distinct intermediates. By characterizing these intermediates, we clarified the order of β subunit incorporation in the iCP and tCP. As we showed previously, β subunits were incorporated strictly and sequentially in the order β2, β3, β4, β5, β6, β1, and β7 in the sCP. However, β5i and β5t could be incorporated immediately after the assembly of β3 even without β4 in the iCP and tCP, respectively. Furthermore, β1i and β2i were incorporated ahead of all the other β subunits (Figure 2).

To elucidate the mechanism of earlier incorporation of β5i and β5t compared to β5, we focused on their propeptides. Two chimeric β5 subunits were constructed by fusing the propeptide of β5i or β5t to the mature form of β5. Here we refer to these chimeric subunits as β5i(p)+ β5(m) and β5t(p)+ β5(m). We expressed these subunits into cells depleted of endogenous β4 and β5 and observed whether the chimeric β5 subunits were incorporated without β4. β5i(p)+β5(m) was not incorporated in the absence of β4, suggesting that the mature body of β5i, but not the propeptide of β5i, was prerequisite for β5i incorporation (Figure 3). In contrast, β5t(p)+ β5(m) was readily incorporated without β4, indicating that the propeptide of β5t enabled earlier incorporation of β5 to the premature proteasome (Figure 3).

To sum up, the assembly of the iCP and tCP began with the incorporation of β1i and β2i, followed by incorporation of β3, then β4 or β5i/β5t, and β6 and β7 were the last two to be incorporated. In the assembly pathways, the propeptide of β5t is a key factor for its earlier incorporation than β4, while the mature form of β5i is thought to be more crucial to its earlier incorporation. These unique features of β5t and β5i may account for preferential assembly of the iCP and tCP over sCP even when standard and specialized subunits are co-expressed.

1-2. Incorporation of β5t is largely dependent on β1i and β2i

Since β1i and β2i are the common catalytic subunits of iCP and tCP, we examined whether there was any difference in the dependence of β5i and β5t incorporation on the presence of β1i and β2i. β5i and β5t were synthesized with N-terminal propeptides as premature forms. Those propeptides are cleaved upon completion of the CP assembly to expose the catalytic threonine residues, and therefore, processing of the propeptides indicates efficiency of the CP assembly. We expressed β5t or β5i in β5i (-/-) MEF cells. These cells express β1i and β2i only when treated with IFN-γ. Nearly half of the expressed β5t were in premature forms without IFN-γ, but the mature β5t was remarkably increased upon IFN-γ treatment. In contrast, the majority of β5i were already matured in the absence of IFN-γ, and the induction of β5i maturation by IFN-γ was modest (Figure 4). These results indicated that presence of β1i and β2i facilitated incorporation of β5t, whereas β5i could be incorporated efficiently in combination with the standard subunits β1 and β2. This may account for generation of altered TCR repertoire of CD8+ T cells in β1i- and β2i-deficient mice, as reported previously.

2. Dissecting assembly pathway of the lid subcomplex

In order to dissect the assembly pathway of the lid subcomplex, we analyzed specific intermediates observed during knockdown of each lid subunit in HEK293T cells by immunoblot and mass spectrometry analysis. When treated with siRNA targeting Rpn12, a complex comprising all the lid subunits except Rpn12 was detected, indicating that Rpn12 was the last subunit incorporated during the lid formation (Figure 5C). When we knocked down Rpn6, two intermediate complexes Rpn3-7 and Rpn5-8-9-11 were observed, suggesting that these two intermediates were formed independently and bound to each other via Rpn6 (Figure 5D). While the association between Rpn3 and Rpn7 was not essential for the stability of either subunit, Rpn5, Rpn8 and Rpn9 were not able to form an intermediate complex without any one of the other subunits, indicating that these three subunits assembled as a set. Additionally, Rpn11 was markedly decreased by knockdown of Rpn5 and Rpn8, indicating that stability of Rpn11 was dependent on the Rpn5-8-9 complex.

Since no effective antibody against human Rpn15 was available and it was impossible to detect fragmented peptides derived from Rpn15 by our MS analysis due to the detection limit after trypsin digestion, we constructed HEK293T cells stably expressing Rpn15-Venus. An intermediate comprising the lid subunits except Rpn3 and Rpn12 was identified in Rpn15-knockdown cells, and no subunit was co-immunoprecipitated with Rpn15 when we knocked down Rpn3, suggesting that Rpn3 and Rpn15 were assembled into the lid in an interdependent manner.

In brief, an intermediate comprising Rpn5-6-8-9 served as a core module that was prerequisite for assembly of the essential deubiquitinase Rpn11, which then associated with Rpn15-3-7 complex. Rpn12 was the last subunit to be incorporated (Figure 6). The lid formation did not seem to be assisted by any specific chaperones, like CP and the base assembly, because we did not detect molecules other than the lid subunits in the intermediates of lid subcomplex by MS analysis.

[Discussion]

1. It has been known that pre-CPs containing β1i and β2i favored the incorporation of β5i because β5i mediated efficient processing of β1i and enhanced the effectiveness of CP assembly. We showed that incorporation of β5t was dependent on β1i and β2i more than that of β5i (Result 1-2), and the propeptide of β5t played an essential role in its incorporation. This feature of β5t might explain the fact that more than 90% of the CPs is the tCP in cTECs while β5t and β5i are transcriptionally co-expressed.

2. Recent research has discovered that overexpression of Rpn6 subunit in C. elegans and Rpn11 in fruit fly prolongs the lifespan. It is also shown that FOXO4-mediated upregulation of Rpn6 is a prerequisite for maintaining pluripotency in embryonic stem cells. Overexpression of Rpn11 or Rpn7 is also known to be involved in DNA damage response. However, the mechanisms are still unidentified. Elucidating the assembly pathway of the lid subcomplex should be of help to understand the mechanism in which high expression of a single lid subunit plays such significant roles.

Figure 1. Structure of 26S protcasome

Figure 2. β-ring assembly pathway of the 20S thymoproteasome

Figure 2. Propeptide of β5t could assist carlier incorporation of β5.

Figure 4. Maturation of β5t was facilitated by β1i and β2i.

Figrue 5. Two intermediates was formed during the assembly, and Rpn12 was incorporated at the final step of the lid formation.

Figrue 6. Assembly pathway of the lid subcomplex

本論文は、真核細胞内で必須のタンパク質分解酵素であるプロテアソームについて、

(1)免疫プロテアソームと胸腺プロテアソームの形成過程

(2)26Sプロテアソームの19S複合体蓋部の形成過程

を詳細に解析したものである。

ユビキチン化タンパク質を選択的に分解する26Sプロテアソームはタンパク質分解を実行するコア粒子である20Sプロテアソームと、タンパク質分解のための前処理、すなわちユビキチン鎖の捕捉、ATPaseによる基質の巻き戻しと20Sプロテアソーム内への送り込み、基質からのユビキチン鎖の切り離しなどを行う19S複合体から形成されている。

真核生物の20Sプロテアソームは7種のαサブユニットと7種のβサブユニットがそれぞれリング状構造を形成し、それがαββαと4層に重なった樽状構造を持つ。触媒活性を持つのはβ1、β2、β5サブユニットでそれぞれカスパーゼ様、トリプシン様、キモトリプシン様の活性を示す。20Sプロテアソームは古細菌にもあるが、古細菌の20Sプロテアソームは各一種類のαサブユニットとβサブユニットから形成され、キモトリプシン様の活性しか持たないことから、真核生物のプロテアソームになってペプチダーゼ活性を3種類に増やし、それが保存されていることは進化的に興味のあるところである。さらに、脊椎動物になると免疫プロテアソーム、胸腺プロテアソームという触媒サブユニットが標準型から組織特異的なサブユニットに置換された特殊なプロテアソームを持つことがわかっている。免疫プロテアソームではβ1、β2、β5がβ1i、β2i、β5iに、胸腺プロテアソームでは免疫プロテアソーム型からさらにβ5iがβ5tに置換されβ1i、β2i、β5tを持つ。

(1)については、酵母からヒトに至るまで保存されたタイプの20Sプロテアソームである標準プロテアソームと、脊椎動物に特異的に存在する二つのタイプの特殊型20Sプロテアソームの形成機構がどのように異なるのか、すなわち、免疫プロテアソームおよび胸腺プロテアソームが標準プロテアソームに対して優先的に形成される仕組みを明らかにしようとする研究である。個々のサブユニットのsiRNAを用いたノックダウンと、その結果蓄積する中間体の性状を綿密に調べることにより、免疫および胸腺プロテアソームの触媒サブユニットβ1i、β2i、β5i、β5tが、標準プロテアソームの相同触媒サブユニットβ1、β2、β5よりもプロテアソーム形成時に優先的に早い時期に取り込まれることが分かった。また、βサブユニットは20Sプロテアソームに組み込まれてからN末端のプロペプチドが切断され成熟型となるが、このプロペプチドはβサブユニットが20Sプロテアソーム前駆体に取り込まれ20Sプロテアソームを形成する際に重要な働きを持つことがわかっている。本論文では、このプロペプチド配列にも注目し、標準型プロテアソームにおいてβ5の組み込みはβ4の後であるが、β5tはβ4に依存せずプロテアソームに組み込まれること、そしてこのβ5tが標準型β5より早く組み込まれることを可能にするβ4依存性の解除はβ5tのプロペプチドに依ることを明らかにした。さらに、β5tの取り込みはβ1i、β2iの先行した取り込みに強く依存していることが明らかとなり、この仕組みにより胸腺上皮細胞において均一な胸腺プロテアソームの形成が保証されることを示した。この仕組みは、胸腺上皮細胞におけるCD8 T細胞の正の選択を支える仕組みであり、免疫学的にも重要な発見である。

一方、19S複合体は20Sプロテアソームの活性調節に働く、19種類のサブユニットから形成されている複合体である。19S複合体はさらに蓋部と基底部に分けられる。基底部は6種の相同なATPaseを含み、先に述べたように基質の巻き戻しや20Sプロテアソーム内への基質の送り込みを担っていると考えられている。一方、蓋部には脱ユビキチン化酵素であるRpn11を除き、配列から各サブユニットの機能を類推出来るようなものはなく、何故このように大きな複合体を形成する必要があるのか、未だに不明である。また、基底部の形成は基底部形成のためのシャペロン分子が近年同定され、形成過程が明らかになってきたが、蓋部の形成過程に関しては全く不明であった。

そこで(2)については、9個のサブユニットからなる19S蓋部の形成機構について、個々のサブユニットのsiRNAによるノックダウンにより蓄積する中間体について、質量分析を駆使することによりその内容を明らかにした。その結果、蓋部がさらにRpn3, Rpn7, Rpn15とRpn5, Rpn6, Rpn8, Rpn9という二つのサブコンプレックスに分けられ、それぞれが独立して形成された後に会合して完成することを明らかにした。20Sプロテアソームや19S複合体基底部においては、中間体特異的に結合するプロテアソーム形成シャペロンが同様な実験を行うことによって同定され、それらのシャペロン分子が形成に重要な働きを担っていることがわかっている。蓋部形成にも何らかのシャペロン分子が関わっている可能性を考え、中間体形成機構解明と同時にそのような分子の同定も同時に試みたが蓋部中間体にはそのようなシャペロン分子と思われる分子は同定されなかった。また、Rpn11の蓋部への組み込みはRpn5-Rpn6-Rpn8-Rpn9から形成されるサブコンプレックスに依存していることも示した。蓋部はユビキチン化タンパク質からユビキチン鎖を外すという、タンパク質分解において必須の過程をになう複合体であり、実際にその触媒活性を担うRpn11サブユニットを確実に配置させるための形成機構となっていることが示唆された。さらに、Rpn12は二つのサブコンプレックスが結合後に組み込まれ、Rpn12の組み込みを持って蓋部の完成とみなすことが出来ることも判明した。

得られた結果からは、どのサブユニットが直接相互作用するかどうかも推察することができ、構造的解析の面でも大きな知見を与える研究である。さらに、近年蓋部サブユニットのRpn6の発現が高いことが胚性幹細胞の多能性の維持や、線虫の寿命延長に重要であることが他のグループの研究により明らかとなっており、そのメカニズムを理解するための重要なプラットフォームとなる研究であり、今後さらに生物学的重要性の観点からも価値を増す研究となると考えられる。

以上の研究により、多数のサブユニットから構成されるプロテアソーム複合体がどのように秩序正しく形成されるのか、その仕組みについて丹念に得た結果から、緻密にモデルを組み立てることに成功した。これらの理解は、特殊型プロテアソームや蓋部が真核生物、特にヒトにおいてもつ重要な生物学的意義、すなわち免疫システムの構築や胚やiPS細胞の多能性維持、個体の寿命についてさらなる理解の進展に資するところが大きい。よってこれを行った白明慧は博士(薬学)の学位を得るにふさわしいと判断した。