H.somnus菌体から界面活性剤N-lauroylsarcosine(Sarkosyl)に不溶性の外膜画分を調製し、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により分析すると、最も多量に検出される質量40キロダルトン(kDa)の主要外膜タンパク質(MOMP)が認められた。まずはじめに、このMOMPの分離精製方法を検討した。Sarkosyl不溶性外膜画分から、非イオン性界面活性剤Zwittergent 3-14を用いてMOMPを可溶化し、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過法により精製MOMPを得た。精製MOMPは、N末端アミノ酸配列分析の結果、グラム陰性菌の外膜の透過孔形成に与るポーリンタンパクとホモロジーを示した。次に、MOMPの免疫原性および抗原性状について検討した。精製MOMPで高度に免疫したウシおよびウサギはMOMPに対して強い抗体応答を示した。ウサギ高度免疫血清を用いて、イムノブロット法により4株のH.somnusとの反応性を調べたところ、4株共通に質量40kDaのバンドとの反応が認められたが、それらの菌株のうち1株との反応がやや弱かった。そこで、MOMPの抗原性の違いを確認するために、MOMPに対する2クローンのMAbを作製し、4株のH.somnusの外膜画分を抗原とした固相酵素免疫測定法(ELISA)または全菌体抗原を用いたイムノブロット法により反応性を検討した。MAb57-16-2はELISAにおいて4株の抗原と反応したが、MAb68-4-3はELISAおよびイムノブロット法において3株の抗原とのみ反応した。したがって、H.somnusのMOMPは、菌株によって抗原性に違いのあることが明らかとなった。

　MOMPの抗原性状をより明確にするために、MOMPに対するMAbをさらに作製し、抗原性状の分析を行った。ELISA、イムノブロット法および免疫沈降法により、MOMPに対する特異性が確認された7クローンのMAbを得た。7クローンのMAbと45株のH.somnus供試菌株との反応性には5種類の異なる反応パターンが認められた。すなわち、MOMPには、7クローンのMAbにより認識される少なくとも5種類の異なる抗原エピトープが存在することが示された。次に、MAbのH.somnus以外のグラム陰性菌との交差反応性をイムノドット法により検討した結果、6クローンのMAbは、H.somnusと分類学的に類似するヒツジ由来菌Haemophilus agniまたはHistophilus ovisと交差反応を示し、それらのうちの1クローンのMAbは、さらにイヌ包皮腔由来菌Haemophilus haemoglobinophilusとも交差反応を示した。しかし、いずれのMAbも他の11種2亜種の供試グラム陰性菌とは交差反応性を示さず、これらのMAbの反応性はかなり菌種特異的であった。次に、それぞれのMAbが認識する抗原エピトープの表在性を、金コロイドプローブを用いた免疫電顕法により検討したところ、MOMPには、反応性の異なる3種類の表在性エピトープが存在していることが示された。以上の成績から、H.somnusのMOMPは少なくとも5種類の抗原エピトープをもつ表在性のタンパク質抗原であること、H.somnusは菌株によりMOMPの抗原構造に違いが認められること、しかし、表在性エピトープのうちのひとつはH.somnus供試菌株全てに認められることが示された。MOMPの抗原性の違いに基づくH.somnusの血清型別システムの開発が期待される一方、MOMP抗原は、ワクチンや免疫学的診断用抗原の開発にも応用可能なタンパク質抗原のひとつであると考えられる。

　グラム陰性菌のOMPには、SDS存在下での加熱処理温度の違いにより、SDS-PAGEでの移動度に変化を示す、いわゆるheat-modifiable OMPが存在することが報告されている。H.somnusの外膜画分を異なる温度条件で可溶化し、SDS-PAGEで分析すると、60℃では28kDa OMPは認められたが、37kDa OMPは認められなかった。しかし、100℃で可溶化すると、37kDa OMPが認められるようになると同時に、28kDa OMPはほとんど認められなくなった。SDS-PAGEの結果は、MAb(MAb27-1)を用いたイムノブロット法においても確認され、H.somnusの37kDa OMPおよび28kDa OMPは同じOMPのheat-modified formおよびnon-heat-modified formであることが明らかとなった。グラム陰性菌のheat-modifiable OMPとして、Escherichia coliのOmpAタンパクが知られている。MAb27-1は、E.coli OmpA保有株とのイムノブロット法においてOmpAタンパクに相当する質量35kDaの抗原バンドと反応したが、OmpA欠失株とは反応しなかった。また、H.somnus37kDa OMPのN末端アミノ酸配列はOmpAタンパクとホモロジーを示したことから、H.somnus37kDa OMPはOmpA相同タンパクであると考えられた。次に、37kDa OMPに対するH.somnus実験感染牛の抗体応答を、外膜画分抗原を用いたイムノブロット法により検討した。その結果、感染前血清ではいずれのOMPとも反応が認められなかったが、回復期血清ではいくつかのOMPと反応が認められるようになり、そのなかでも37kDa OMPとは強い反応が認められた。したがって、本菌感染牛は37kDa OMPに対して強い抗体応答を示すことが確認された。次に、37kDa OMPのH.somnus菌株間での保存性や他菌種の抗原との交差反応性、さらに菌体表面での抗体との結合性ついて検討した。その結果、MAb27-1は45株のH.somnus供試菌株すべてと反応したが、検出された抗原の分子量には菌株により差が認められた。また、MAb27-1はH.somnusだけでなくPasteurellaceae科の6菌種、さらにE.coli、Salmonella Dublinとも交差反応を示した。したがって、免疫学的診断法に本抗原を応用した場合には、偽陽性反応が生じる可能性が高い。また、MAb27-1エピトープは表在性ではないが、H.somnus実験感染牛血清のH.somnus生菌による吸収試験の成績から、37kDa OMPは表在性の抗原構造をもつことが示された。今後、37kDa OMPの表在性エピトープの性状を明らかにし、ワクチン抗原としての有用性を検討する必要がある。

　Haemophilus influenzaeのペプチドグリカン結合リポタンパクであるP6タンパクは、抗原性と分子構造がほぼ均一なタンパク抗原であることが報告されており、ワクチン抗原の候補のひとつとして注目されている。そこで、H.somnusの外膜画分を出発材料として、P6タンパクの調製法に準じてSDS不溶性画分を分離し、SDS-PAGEにより分析したところ、17.5kDaの単一のタンパク質バンドが検出された。次に、この17.5kDa OMPに対するMAb(MAb20-3-5)を作製し、抗原性状の分析を行った。イムノブロット法において45株のH.somnus供試菌株すべてに、MAb20-3-5と反応する17.5kDaの抗原バンドが認められた。MAb20-3-5はH.agni,H.ovisおよびH.haemoglobinophilusと交差反応を示したが、供試した他の11種2亜種のグラム陰性菌とは反応が認められなかった。また、免疫電顕法および抗体吸収試験によりMAb20-3-5の認識する抗原エピトープは表在性であることが確認された。H.somnus実験感染牛の感染前血清は17.5kDa OMPとの反応が認められなかったが、回復期血清はl7.5kDa OMPとかなり強い反応を示した。以上の成績から、H.somnusの17.5kDa OMPは本菌感染症に対するワクチンや免疫診断法への応用が期待できるタンパク抗原であると考えられる。