ウナギCT(eCT)に対して高い反応性を有する細胞株を選択し、新たなin vitro活性測定法となり得る反応を探索することを企図した。短期作用としてcAMP産生を、長期作用として細胞形態変化を指標とし、腎、血球、乳癌由来の37細胞株の中からブタ腎尿細管上皮由来細胞株LLC-PK₁細胞を選択した。

　増殖期のLLC-PK₁細胞を10^-9MのeCT存在下に3日間培養したところ、多数のvacuoleの出現等、細胞形態の著しい変化が観察され、生存細胞数が顕著に減少していた。魚類・鳥類CT、哺乳類CTともLLC-PK₁細胞でcAMP産生を促進するが、この形態異常・増殖阻害は魚類・鳥類CTによってのみ惹起された。8-Br-cAMPとphorbolmyristateacetate(PMA)との共存によりLLC-PK₁細胞の形態異常・増殖阻害を再現できたことから、魚類・鳥類CTによるLLC-PK₁細胞の形態異常誘導はadenylate cyclaseとC-kinaseの活性化を必要とすること、哺乳類CTはadenylate cyclaseは活性化するがC-kinaseを活性化する能力を持たないことが示唆された。

　一方、confluentな状態のLLC-PK₁細胞に対してeCTを作用させても形態変化は起こらないが、グルコース消費が昂進することが新たに確認された。この作用も魚類・鳥類CTで惹起されるが哺乳類CTや他のcAMP産生促進物質、8-Br-cAMPでは観察されなかった。PMAは単独でLLC-PK₁細胞のグルコース消費を昂進し、またeCTによるグルコース消費昂進はC-kinase阻害剤のH-7で抑制された。この結果から魚類・鳥類CTによるLLC-PK₁細胞のグルコース消費昂進はC-kinaseの活性化を介すること、哺乳動物CTはやはりC-kinaseを活性化しないとが示唆された。

　従来、哺乳類CTより魚類・鳥類CTの方が哺乳動物でのin vivo活性が強い理由は、受容体に対する親和性の違いによるとされてきた。ところが本研究の結果から、活性化し得る細胞内情報伝達経路の違いが原因である可能性が示唆され、C-kinase活性化をも考慮に入れた、新しいCTのin vitro活性測定系の必要性が確認された。そこで、本研究で新たに見いだされたLLC-PK₁細胞の形態変化誘導・増殖抑制作用とグルコース消費昂進作用のうち、より簡便かつ安価で再現性の良い、色素染色による増殖抑制作用の定量をCTの新規in vitro活性測定系として用いることにした。

　これまでに、魚類CTを用いた研究から以下の知見が得られている。

　1)8-22位は両親媒性a-helix構造をとる必要がある。

　2)Lys¹¹、Lys¹⁸をアセチル化すると活性が低下する。

　3)cAMP産生に関与する部位は、CT分子の中央付近からN末端側にわたって存在する。

　4)受容体結合に関与する部位は、CT分子のC末端付近に存在する。

　本研究においては,活性発現に必須と考えられる残基を選択してこれを連続的にずらした位置に挿入する、新規な方法で誘導体をデザインした。活性発現に必要な配列中に挿入された場合は活性が低下すると予測されることから、その部位を特定することができる。この方法を以下に"挿入失活法"と呼ぶ。挿入失活法でデザインされたペプチドの長さ、アミノ酸組成は同一であるため、これらの因子の変化を除外することができる。本研究においては、最もin vivo活性が強いCTの一つであるeCTについて誘導体を合成し、その活性比較から構造活性相関を検討した。

　ペプチド合成機を用いて固相法で合成した各誘導体は、LLC-PK₁細胞での¹²⁵I-eCTとの競合阻害を指標とした受容体結合、cAMP産生、及び新たに見いだした増殖阻害の各反応により活性を評価した。まず、Lys¹⁸を欠失した誘導体dKについて活性を調べたところ、各活性ともeCTに比べ、2-3 orderの低下が観察され、Lys¹⁸はeCTの活性発現に必須であることが確認された。次いで、Lys¹⁸を12位から32位にわたって移動挿入した20個の誘導体(以下、Lysを挿入した位置の番号でK12、K13、・・・・、K32と表す)を合成し、活性比較を行なった。その結果、K12からK16の誘導体は3つの活性すべてが著しく低下しており、K17からK24はeCTとほぼ同等の活性を保持していた。K25からK32は、cAMP産生活性は保持していたが、受容体結合活性、増殖阻害活性は低下した。活性発現に必要な配列中にLysが挿入された場合に活性が低下すると予測されることから、12位から16位は受容体結合とadenylate cyclase活性化に関与する部位、25位から32位は受容体結合と、恐らくC-kinaseの活性化に関与する部位であることが示唆された。

　eCTの活性発現に必要と推察された上記二つの部位のうち、前半の12位〜16位は、従来両親媒性a-helix構造が必要とされてきた8位〜22位の範囲に含まれる。そこで次に、各誘導体の両親媒性a-helix構造と、活性との相関について検討を行なった。アミノ酸組成が同一であるペプチドは、両親媒性が高いほど逆相HPLCでのretention timeが遅いという報告がなされている。各ペプチドについて逆相HPLCでの挙動を検討したところ、K12〜K16は他のペプチドより著しく早く溶出され、両親媒性が低下していると判断された。Circular dichroism測定によりa-helix含量は低下していないことが確認されたことから、K12〜K16はa-helix構造は保持していたが両親媒性が成立していないと予測された。そこで各誘導体についてEdmundson helical wheel plotを行なったところ、8位から17位の範囲でplotした場合に両親媒性の成立と活性とがよく一致しており、これより長い範囲にわたってplotした場合には一致しなかった。従って、両親媒性a-helix構造をとることが必要な部位は、8位から17位までであることが明らかとなった。また最初に見たdKの活性は、3つの系すべてで低下していたが、18位は両親媒性a-helix構造が必要とされる範囲に含まれていないこと、及び本研究以前の知見を考慮すると、Lys¹⁸の正電荷が受容体結合及びadenylate cyclase活性化に必要であったと推察された。