ラット胸部大動脈を用いたin vitroの研究において、FK409(1×10^-7M)はnorepinephrine(1×10^-7M)により収縮させたラット摘出大動脈標本において,FK409投与後、血管組織中のcGMPレベルは徐々に増大し3分後にピークに達した。また、血管は経時的速やかに弛緩した。一方、血管組織中のcAMP値は若干増加する傾向を示したが、何れの時点においても有意な変化を示さなかった。Nitroglycerin(1×10^-6M)処置の場合もFK409処置の場合と同様の結果であったが、cGMP値はFK409処置の場合より速やかに上昇し、30秒後にピークに達した後、徐々に減少した。次に、norepinephrine(0.1M)により収縮させたラット摘出大動脈標本を用い、FK409及びnitroglycerinの血管弛緩作用とcyclic nucleotideレベルに対する用量作用依存性を検討した。

　FK409(1×10^-9-1×10^-6M)は血管組織中のcGMPレベルを用量依存性に増加させるとともに、用量依存性の血管弛緩作用を示した。一方、cAMP値は増加傾向を示したが、何れの濃度においても有意な変化を示さなかった。Nitroglycerin(1×10^-9-1×10^-6M)もFK409とほぼ同様な結果であった。FK409処置によるラット胸部大動脈組織中のcGMPレベルの増加を伴う血管弛緩作用は、内皮細胞の除去を行っても殆ど影響を受けなかった。更に、ラット胸部大動脈を用いた実験において、FK409の血管弛緩作用はL-NMMA(内皮細胞でのL-arginineからNOの生成阻害剤)前処置により全く影響されず、NOのスカベンジャーであるoxyhemoglobin前処置によっても若干抑制されたのみであった。一方、FK409は血管弛緩作用を示す3.2×10^-7Mの用量において、ラット胸部大動脈より調整した可溶性guanylate cyclase活性を顕著に活性化した。10nMのoxyhemoglobin前処置により、この活性化作用は殆ど抑制された。以上の結果より、FK409の血管弛緩作用はacetylcholineの場合とは異なり,内皮細胞非依存性であり、平滑筋細胞内においてFK409構造分子そのものからのNOの遊離を介する可能性が示唆された。そこで、ラット胸部大動脈より調整したホモジュネート画分を用いてFK409のNOの産生能について検討したところ、FK409はsulfhydryl供与基であるL-cysteineの存在の有無に関係なくNOを産生した。一方、nitroglycerinはL-cysteineの存在下ではNOの産生を示したが、L-cysteineの非存在下ではNOを殆ど産生しなかった。更に、NOにより活性化されるguanylate cyclaseに対する作用を検討したところ、nitroglycerin(1×10^-6-1×10^-4M)はL-cysteine非存在下ではラット胸部大動脈より調整した可溶性guanylate cyclase活性の増強作用を殆ど示さなかったのに対し、FK409(1×10^-7-1×10^-5M)はL-cysteineの有無にかかわらず用量依存性に可溶性guanylate cyclase活性を増大させた。この結果はFK409がL-cysteineの存在の有無に関係なくNOを産生した結果と合致するものであった。また、家兎の血管より調整したcGMP-phosphodiesterase活性に対してFK409は1×10^-5Mの高用量においても全く阻害作用を示さなかった。一方、cGMP-phosphodiesteraseの競合阻害剤として知られているM&B22,948は本酵素を阻害した(IC50:3.7×10^-7M)。

　摘出イヌ冠血管標本を用い血管弛緩作用耐性の検討を行った。高濃度の薬物60分間処置により耐性を誘導した。FK409による弛緩作用の用量作用曲線はFK409またはnitroglycerinにより耐性を誘導する前のそれと殆ど差を認めず、EC50値も変化しなかった。一方、nitroglycerin及びisosorbide dinitrateの弛緩作用の用量作用曲線は各々の薬物高濃度処置前のそれに対して右方にシフトし、それぞれの薬物高濃度処置により弛緩作用の減弱ないし減弱傾向を示した。更に、ラットを用いてFK409の降圧作用耐性を検討した。

　FK409またはnitroglycerin4日間連続投与(1日3回、皮下投与)により、5日目のFK409の血圧下降作用は殆ど減弱しなかったが、nitroglycerinまたはisosorbide dinitrate4日間連続投与(1日3回、皮下投与)による各々の薬剤の血圧下降作用は有意に減弱した。これらの結果より、nitroglycerin及びisosorbide dinitrateは容易に自己耐性を発現するのに対し、FK409は自己及び交叉耐性を発現しにくい事が明らかになった。現在、硝酸薬の作用耐性は平滑筋細胞内でのsulfhydryl供与基(L-cysteine等)の枯渇により発現する可能性が最も有力である。なぜならば、硝酸薬は酵素的に還元されてNOまたはS-nitrosothiolを産生させるが、この反応の過程においてsulfhydryl供与基が必要とされている。FK409の血管弛緩作用の生化学的メカニズムについての検討成績より、FK409は平滑筋細胞内でのsulfhydryl供与基(L-cysteine等)の枯渇が生じた場合にもNOを十分産生する事により弛緩作用を示し、作用耐性が生じにくい可能性が強く示唆された。

　(1)FK409の血管弛緩作用は内皮細胞非依存性であり、内皮細胞からのNOの遊離を介さずに生じることが示唆された。実際、FK409はL-cysteineの有無に関係なくラット大動脈より調整した可溶性画分中にてNOを産生した。血管平滑筋細胞内においてsulfhydryl基の非存在下でもFK409構造分子そのものよりNOが遊離し、cGMPレベルが上昇することが本剤の血管弛緩作用の主体と考えられた。更に、FK409はイヌ摘出冠血管標本及びラットを用いた血圧下降作用の検討において、自己耐性及びnitroglycerin、isososorbide dinitrateとの交叉耐性が生じにくいことが明らかとなった。

　(2)FK409は強力な冠血管拡張作用物質であり、特に太い冠動脈部位に対して選択的に強い弛緩作用を示した。その効力はnitroglycerinより5-26倍強かった。また、FK409は麻酔イヌの心筋虚血モデルにおいて、心筋虚血部の血流量の増大及び血流分布を改善した。更に、犬の労作性狭心症モデルやラットの異型狭心症モデルにおいて、FK409は静脈内及び十二指腸内投与により抗狭心症作用を示した。この結果は、nitroglycerinとは異なりFK409は初回通過効果を比較的受けにくいことに基づくものと考えられた。更に、FK409はウサギの伏在動脈よりも静脈に対して弛緩作用が強いことより、静脈灌流量を減少させ心筋酸素消費量を減少させる事も期待される。

　以上の検討結果より、FK409はユニークな作用機序を有する、経口投与可能な作用耐性の生じにくい抗狭心症薬になるものと考えられる。

　Norepinephrineにより収縮させたラット胸部大動脈を用いた実験において、FK409処置による血管組織中のcGMPレベルの増加を伴う血管弛緩作用は、内皮細胞の除去を行っても殆ど影響を受けなかった。更に、FK409はL-cysteineの有無に関係なくラット大動脈より調整した可溶性画分中にてNitric Oxide(NO)を産生した。一方、nitroglycerinはL-cysteineの存在下ではNOの産生を示したが、L-cysteineの非存在下ではNOを殆ど産生しなかった。血管平滑筋細胞内においてsulfhydryl供与基(L-cysteine等)の非存在下でもFK409構造分子そのものよりNOが遊離し、cGMPレベルが上昇することが本剤の血管弛緩作用の主体であることが明らかとなった。

　イヌ摘出冠血管標本及びラットを用い,血管弛緩作用及び血圧下降作用の耐性発現の検討を行った。その結果,FK409は自己耐性及びnitroglycerin,isosorbide dinitrateとの交叉耐性が生じにくいことが明らかとなった。一方,nitroglycerin及びisosorbide dinitrateは容易に自己耐性を発現した。現在、硝酸薬の作用耐性は平滑筋細胞内でのsulfhydryl供与基の枯渇により発現する可能性が最も有力である。FK409は平滑筋細胞内でのsulfhydryl供与基の枯渇が生じた場合にもNOを十分産生する事により血管弛緩作用を示し、作用耐性が生じにくいとの予想が本研究により実証された。

　FK409は強力な冠血管拡張作用物質であり、特に太い冠動脈部位に対して選択的に強い弛緩作用を示した。その効力はnitroglycerinより5-26倍強かった。また、FK409は麻酔イヌの心筋虚血モデルにおいて、心筋虚血部の血流量の増大及び血流分布を改善した。更に、犬の労作性狭心症モデルやラットの異型狭心症モデルにおいて、FK409は静脈内または十二指腸内投与により抗狭心症作用を示すことを確認した。この結果は、nitroglycerinとは異なりFK409は初回通過効果を比較的受けにくいことに基づくものと示唆された。更に、FK409はウサギの伏在動脈よりも静脈に対して弛緩作用が強いことより、静脈灌流量を減少させ心筋酸素消費量を減少させる可能性も示唆した。

　以上、本研究はFK409の抗狭心症作用とその作用機作を研究し、FK409はsulfhydryl基の非存在下でもその構造分子そのものよりNOを遊離し血管弛緩作用を示すことを明らかにし、経口投与可能な作用耐性の生じにくい抗狭心症薬になる可能性を示したものである。よって、本研究は抗狭心症薬の分野に貢献するものであり、博士(薬学)の学位に十分値するものと判断した。