CHO細胞で発現させたrhIL-5は、Matrex Blue A、DEAE-Sepharose、Phenyl-Sepharose、及び、Sephacryl S-200カラムにより精製した。精製したrhIL-5は、SDS-PAGE分析で不均一性を示し、非還元条件下で分子量約40kdに、還元条件下では約20kdにバンドが現れたことから、分子間におけるジスルフィド結合を介した二量体で存在していることが示唆された。そこで、rhIL-5の一次構造上の均一性とジスルフィド架橋様式について調べる為、rhIL-5をアクロモバクタープロテアーゼI(API)を用いて消化後、逆相HPLCにてペプチドマップを作製した。得られたピークのうちただ1つのピークのみが還元条件により消失し、新たに2つのピークに分離して現われたことから、このピークはシステインを含むペプチドであることが予想された。全てのピークに関しアミノ酸配列及び組成分析を行ったところ、cDNAの塩基配列より推定された全てのペプチド断片を検出し、これらはほぼ定量的に90%回収された。従って、rhIL-5は一次構造上均一であることが示唆された。また、先のピークはCys-44とCys-86を含むペプチドであったことから、rhIL-5は分子間における2組のジスルフィド結合を介した逆平行二量体を形成していることが判明した。糖鎖結合部位については、アミノ酸配列分析の結果から、Thr-3にムチン型糖鎖が、Asn-28にAsn型糖鎖が結合し、一次構造の配列からAsn型糖鎖の結合が予想されたAsn-71には糖鎖が結合していないことが明らかになった。また、同一アミノ酸組成でありながら逆相HPLCにて別々に溶出したペプチドが存在し、これらは糖鎖の不均一性によるものと考えられた。rmIL-5もrhIL-5と同様に構造を確認し、両者の比較研究を行った。rhIL-5とrmIL-5の一次構造はそれぞれ115残基と113残基のアミノ酸からなり、逆平行二量体として存在した。また、rmIL-5の糖鎖結合部位は、Asn-26、55に糖鎖が結合し、Asn-69は糖鎖の結合可能部位でありながら糖鎖は結合しておらず、rhIL-5のAsn-71と同様の傾向を示した。

　rIL-5のジスルフィド結合を介した二量体構造が、生物活性の発現に重要か否かを調べた。生物活性は、マウス慢性B白血病細胞BCL₁に対するIgM産生誘導能を指標にした。rmIL-5を2-メルカプトエタノールで還元後N-エチルマレイミドによりアルキル化した単量体rmIL-5を作製し、生物活性を調べたところ、単量体rmIL-5は生物活性を失っていた。そこで、単量体rmIL-5の受容体への結合能を¹²⁵Iで標識したrmIL-5を用い競合実験で調べたが、単量体rmIL-5は未処理のrhIL-5の受容体への結合を阻害せず、受容体に結合しないことが判明した。従って、rIL-5の二量体形成が生物活性を発現する為の受容体結合に必須であることが明らかとなった。

　rIL-5の生物活性の発現に重要なアミノ酸残基を探る為、各種アミノ酸残基について化学修飾を行い生物活性を調べた。rmIL-5は、前項でも示したCysのジスルフィド結合の開裂によるアルキル化以外にも、MetをクロラミンTにより酸化した場合に失活した。さらにMetの部位特異性を調べる為、6残基のMetを有するrmIL-5の代わりに1残基のMetしか有さないrhIL-5を用いて調べたところ、rhIL-5はMet-107の酸化に依存して失活した。従って、rIL-5のC-末端付近の高次構造の重要性が示唆された。尚、酸化したrhIL-5は、CD分析により未処理のrhIL-5と比較して、全体の高次構造が大幅に変化していないことを確認した。さらに、C-末端付近の生物活性の発現に重要なアミノ酸残基を決定する為に、カルボキシペプチダーゼYを用いてC-末端のアミノ酸を4残基削ったrhIL-5(1-111)、及び、臭化シアンによりMet-107をホモセリンラクトンにしてC-末端の8残基のアミノ酸を削ったrhIL-5(1-107)を作製し生物活性を調べた。rhIL-5(1-111)が未処理のrhIL-5の4倍以上の生物活性を示したのに対し、rhIL-5(1-107)は生物活性を全く示さなかった。従って、rIL-5の生物活性にはC-末端付近のアミノ酸配列Met¹⁰⁷-Asn-Thr-Glu-Trp¹¹¹(rhIL-5の場合)が重要な役割を担っていることが判明した。

　rhIL-5の糖鎖構造を明らかにする為、まず常法に従いAsn型糖鎖構造を解析した。その結果、rhIL-5は、母核にフコースを持つ、二、三、四本鎖複合型糖鎖、及び、母核にフコースを持たない二本鎖複合型糖鎖と高マンノース型糖鎖を含んでいた。特徴としては、二本鎖複合型糖鎖が約83%あった。また、中性糖鎖は86%を占め、シアル酸を有する糖鎖はわずか14%で、いずれもシアル酸は2→3結合であることが判明した。同様にしてrmIL-5のAsn型糖鎖構造についても解析した。両者で比較すると、rmIL-5の方が高分岐型複合型糖鎖の占める割合が多く、さらに、rmIL-5について部位別に比較するとAsn-55の方が高分岐型複合型糖鎖を多く含んでいた。同じ宿主細胞で発現した組換え体は全て同じ糖鎖生合成経路を利用しているにもかかわらず、アミノ酸配列で糖鎖が異なることより、糖鎖の成熟は蛋白質の立体構造に依存していることが示唆された。

　次に、rhIL-5のムチン型糖鎖構造について解析した。rhIL-5のAPI消化により、ムチン型糖鎖を含む同一アミノ酸からなるペプチドは、逆相HPLCにて2つのピークに分かれて溶出した。これらの画分を個別にシアリダーゼで処理すると、両ピークはいずれも遅れて同じ位置に溶出した。次に、エンド--N-アセチルガラクトサミニダーゼで処理するとさらに遅れて溶出した。この画分をアミノ酸配列分析すると、Thr-3が検出されたことから、rhIL-5のムチン型糖鎖はいずれもシアル酸が結合し母核がGal1→3GalNAcであることが推察された。さらに、先の2つのピークについてそれぞれアルカリ分解後PADを用いたHPAEにて分析し、ムチン型糖鎖は、Neu5Ac2→3Gal1→3(Neu5Ac2→6)GalNAcとNeu5Ac2→3Gal1→3GalNAc構造であることを決定した。

　rhIL-5のAsn型及びムチン型糖鎖が生物活性に与える影響を調べる為、各種グリコシダーゼ消化によりムチン型、Asn型、及び、全糖鎖を除去したrhIL-5を作製した。尚、ムチン型糖鎖の除去にはシアリダーゼ及びエンド--N-アセチルガラクトサミニダーゼを、Asn型糖鎖の除去にはエンドグリコシダーゼFを、全糖鎖の除去には両者で用いたグリコシダーゼを使用した。これらのrhIL-5について生物活性を調べたところ、Asn型糖鎖を除去したrhIL-5は2.8倍、ムチン型糖鎖及び全糖鎖を除去したrhIL-5は10倍程度生物活性が上昇した。さらに、これらのrhIL-5について熱安全性を調べたところ、未処理及びムチン型糖鎖を除去したrhIL-5は70℃まで保温してもほぼ同等の生物活性を保持していたのに対し、Asn型及び全糖鎖を除去したrhIL-5は70℃に保温すると生物活性が大幅に低下した。従って、rhIL-5の糖鎖は生物活性を抑制する傾向にあり、生物活性の発現には必須ではないが、Asn型糖鎖は熱安定性に寄与していることが示唆された。