本論文で研究するBHK(Baby Hamster Kidney)細胞由来のCBP30が、S-レクチンファミリーの一員であることを確認するために、CBP30の部分ペプタイド配列の決定を行った。CBP30は、ほぼ同じ分子量を持つ他細胞由来S-レクチン(CBP35,Mac2,IgE結合蛋白質(eBP))のN末端近傍のプロリン/グリシンを多く含むドメイン及びC末端近傍の糖鎖結合ドメインの配列と約80%の相同性があり、また、抗Mac2モノクローナル抗体と反応した。以上からCBP30は分子量30-35kDaのS-レクチンファミリーの一員であることが示された。

　BHK細胞より精製されたCBP30は、Gal1-3(4)GlcNAC残基に親和性を示し、その結合はpolylactosamine残基やAsn結合複合型糖鎖上のGal-GlcNAc残基の数に比例して強くなった。FucやSiaによる非還元末端のGal残基の置換は、結合にほとんど影響を及ぼさず、1-3結合のGalやGalNAcによる置換は、親和性を約3倍に増加させた。これに対し、GlcNAc残基のFucやSiaによる置換は、糖鎖のCBP30に対する親和性を著しく減少させた。CBP30はマウス癌細胞由来しNや羊水(胎児細胞由来)フィブロネクチン(FN)に結合したが、血漿性(成人細胞由来)FNには親和性を示さなかった。CBP30の糖鎖結合特異性の結果、exo-またはendoglycosidaseを用いたLN上糖鎖の限定消化の結果からも明らかなように、これは、CBP30がLNや羊水FNに含まれ血漿性FNに含まれないpolylactosamine残基や3本鎖、4本鎖複合型糖鎖に結合しているためである。すなわち、CBP30が胎児期に多く観察されるpolylactosamineや高分岐複合型糖鎖を含む糖蛋白質を特異的に認識することができることを示唆する。

　CBP30のLNへの結合活性が、BHK細胞のLNへの接着にどの様な役割を果たしているかを調べるため、LNを限定分解した断片(E1XNd,P1,E8,E3)のCBP30への親和性とBHK細胞のLN断片上への接着が関連しているか検討した。CBP30は用いたすべてのLN断片もに結合したのに対し、BHK細胞の接着と伸張はE8断片をコートしたプレート上のみに観察された。また、このBHK細胞のLNへの接着はCa依存的(CBP30の結合はCa非依存的)で、抗インテグリン抗体により阻害されたが、抗CBP30抗体では阻害されなかった。以上の結果から、CBP30はBHK細胞上のLN受容体として働いていないことが示唆された。一方、培地に加えたCBP30は、10-45g/mlでBHK細胞のLN上の伸張と接着を阻害したので、CBP30は細胞外で抗接着/伸張因子として働くことが推定された。

　S-レクチンは、そのDNA上にシグナル配列を含まない。しかしながら、ハムスターの胎児腎臓切片やBHK細胞で、一部のCBP30が細胞外に見られるので、CBP30を細胞外へ分泌する経路があると考えられる。そこでCBP30の細胞内分布と分泌機構について検討を行った。

　抗CBP30抗体を用いた免疫蛍光法で、CBP30の細胞内局在性を調べたところ、大部分のCBP30は細胞質中、一部は細胞外と細胞膜上に見られた。

　BHK細胞は時間依存的にCBP30を分泌していた。この分泌は、熱ショックやCaイオノファーA23187などにより増加し、methylamine存在下や無血清下では減少した。さらに、ER-Golgi体経由の分泌経路を阻害するbrefeldin Aやmonensinは、CBP30の分泌を阻害しなかったので、CBP30は細胞外へER-Golgi体非依存性経路を経て分泌されると考えられる。

　CBP30はハムスターの胎児賢臓や腸管切片で、上皮細胞のapical側の細胞外に存在することが見いだされている。そこで、CBP30と類似のS-レクチンを含み、フィルター上で培養するとTight junctionが形成され、細胞が分極化するMDCK(Madin-Darby Canine Kidney)細胞を用いてレクチンの局在性と分泌について検討した。レクチンは、Gap junction上部apical側に存在し、分泌もapical側からのみに観察された。ER-Golgi体非依存的な分泌経路には、apical側への分泌経路が関与しているのかもしれない。

　まず、抗Mac2抗体を用いたフルオサイトメトリーで、種々の刺激により誘導された腹腔Mの細胞表面上のMac2の発現を調べた。すでに報告されているのと同様に、TG誘導M上にMac2は多く発現していたのに対し、Mycobacterium microtiやconcanavarin Aで誘導されたMや常在性M上にはMac2は少量しか存在していなかった。細胞表面上のMac2は、Mac2のハプテンであるthiodigalactoside 100mMの前処理により大部分が消失したので、表面上のMac2は糖鎖を介して細胞膜に結合していることが明らかになった。

　腹腔内への刺激剤投与により誘導されたMは、3時間で全Mac2の10-15%を分泌していた。この分泌はCaイオノファ-A23187により著明に増加した。一方、細胞表面にMac2が発現しているのは、TG誘導Mのみであった。細胞表面の大部分のMac2は糖鎖を介して結合していることから、TG誘導Mの細胞表面上にはMac2のリガンドとなりえる糖鎖構造が特異的に発現していると考えられる。そこで、特定の糖鎖に結合する植物レクチンを用いたフルオロサイトメトリーでM細胞表面の糖鎖構造を調べた。全てのM群にpolylactosamine残基や高分岐複合型糖鎖が作在しているのに対し、-Gal残基はTG誘導M上のみに発現されていた。

　Mac2のハムスターホモログであるCBP30の糖鎖結合特異性の結果から明らかなように,非還元末端を-Galで置換したAsn結合高分岐複合型またはpolylactosamine残基は、CBP30に対し高い親和性を持つ。従って、-Galの発現がMac2の細胞表面発現に関与していることが推定される。

　未成熟(WEHI-3)及び成熟(J774.2,P388.D1)M細胞株は、細胞内にほぼ同量のMac2を含み、細胞表面に-Galが発現していた。これに対し、細胞表面上のMac2は、J774.2やP388.D1に強く、WEHI-3に弱く発現していた。成熟Mは3時間で全Mac2の30-50%を分泌するのに対し、未成熟Mではその分泌が見られず、また、その分泌はCaイオノファー存在下でも認められなかった。従って、WEHI-3の細胞表面にMac2が強く発現されないのは、Mac2を分泌するための細胞内のER-Golgi体非依存性の分泌機構が活性化されていないためと考えられた。

　細胞膜非透過性の架橋剤を用いてTG誘導MのMac2のリガンドを検索した結果、分子量92、125、180kDaの蛋白質がMac2の細胞表面上のリガンドであることが明かとなった。また、これらの糖蛋白質の糖鎖にpolylactosamineと-Gal残基が含まれることも確認された。