pSC101同様ori領域内にiteronを持つプラスミドについても精力的に研究が行われているが、iteronの下流の領域が複製に必要である例はpSC101以外には現在のところ見つかっていない。そこでoriの末端に位置するDR-3の下流領域(IR-1を含む約50bp)の機能を探るため、position415〜426の12bpについて一塩基だけ他の塩基に置換させた36種のpoint mutationを作製し、複製能(Ori活性)を調べた。変異導入部位を図1に示す。その結果、わずか一塩基置換でOri活性が著しく低下したものが得られ、置換によって影響をうけたのはposition 420〜422のCACに限られていた。しかも、置換する塩基によってOri活性への影響の度合が異なった。この変異はRep蛋白の変異株でsuppressされたことから、position420〜422のCACとRep蛋白はDNA複製の際に相互作用する可能性が考えられる。

図1.複製開始領域の構造と変異導入部位ori,複製開始領域;dnaA,DnaA蛋白結合配列;IHF,integration host factor結合配列;,84% A+T strech;,direct repear(DR-1,2,and 3);,DR-1〜3と相同性の高いdirect repeat;Prep,rep promoter.

　DR配列とIR配列は相同性が高いにもかかわらず、Rep蛋白二量体はIRにのみ効率よく結合する。また図2に示すようにIR-1,IR-2ともに完全なinverted repeatではない上に、塩基配列も異なる部分があることから、Rep蛋白のDNA結合モチーフを検討した。各half repeatは自己分子内で部分的にinverted repeatになっているため、head to tail(h-t:→→),head to head(h-h:→←),tail to tail(t-t:←→)と配置を変えても三者間で塩基配列が似かよる。従って、IRを構成する四種類のhalf repeat(1L,1R,2L,2R)およびDRがh-t,h-h,t-tに配置したDNAを系統的に合成し、各配列との結合能を調べることでRep蛋白のDNA結合モチーフを検討した。Rep蛋白と効率よく結合した配列の共通性からpseudo-symmetricな5’GGNNTAGNNATTNNNATNN(N)CTAGNCC3’が結合モチーフであると推測できた。これを検証するため、一〜三塩基だけ結合モチーフと異なり結合能が低い四種の配列について、結合モチーフと一致するよう一塩基置換したところ、いずれも結合能が大幅に上昇した。以上のことからRep蛋白二量体のDNA結合モチーフはpseudo-symmetricな5’GGNNTAGNNATTNNNATNN(N)CTAGNCC3’であると結論した。

図2.複製開始領域に存在する繰返し配列

　Rep蛋白二量体はリプレッサー活性を持つがDR配列に結合しにくいことから、イニシエーターは単量体である可能性が考えられる。事実、P1やmini-Fプラスミドでは単量体がイニシエーターであり、二量体から単量体への変換をシャペロンであるDnaK,DnaJが行うことが最近明らかとなってきた。そこでRep蛋白をまず強力な変性剤である塩酸グアニジンで処理し、DR配列への結合に変化が見られるか調べた。その結果6M塩酸グアニジン処理するとDR配列へ効率よく結合するようになった。しかもその結合はIR配列で阻害されなかった。次に、二個のDR配列がhead to tailに並んだDR(h-t)及びhead to headのDR(h-h)をプローブにゲルシフトアッセイを行ったところ、いずれの場合も二段階のシフトが見られRep量が増加すると高分子側にバンドが現れた。この結合はDR配列でのみ阻害され、DR配列の量が増加するに従って高分子側のバンドから消失するが、IR配列では変化が見られなかった。以上のことからDR配列に特異的に結合するのは単量体であり、単量体と二量体では認識配列が異なることが強く示唆された。

　DNA複製の制御を考える上で、in vivoにおいてRep蛋白の単量体と二量体間の変換を何が行っているのか非常に重要な問題である。そこでシャペロンのRep蛋白の構造変換への関与を検討した。大腸菌のシャペロンとしては主にDnaK,DnaJ,GrpEの三者とGroE(GroEL14量体とGroES7量体からなる複合体)の二つのグループがよく知られていることから、これらについて調べた。DnaK,DnaJ,GrpEではRep蛋白のDR配列への結合に変化は見られなかったが、GroEとRep蛋白二量体を反応させると効率は悪いもののDR配列への結合が上昇した。P1やmini-Fプラスミドでは DnaK,DnaJによって効率よく変換されるのに比べ、pSC101の場合GroEによる変換の効率は悪い。そこで二量体から単量体に変換するのではなく単量体を安定化するのではないかと考え、DR結合活性のGroEによる安定化を調べた。グアニジン処理したRep蛋白は25℃において半減期約10分でDR結合活性が減少する。そこでグアニジン処理後GroELを加えたところ、経時的なDR結合活性の減少は見られなくなった。ただし、GroESも作用させないと効率のよいDR結合活性は見られないことから、Rep-GroEL複合体からのRep蛋白の遊離にはGroESが必要であると思われる。また、この反応にはATPの加水分解が必要でありATPのアナログでは反応が見られなかった。

　本研究で明らかにしたことをまとめると

　1.pSC101はori領域内にiteronを持つ一群のプラスミドの中で唯一iteronの下流の領域を必要とするが、わずか一塩基置換でOri活性が著しく低下したOri変異株を複数単離することでこの領域の重要性を確かめることができた。しかもこの変異はRep蛋白の変異株でsuppressされたことからDNA複製の制御を考える上でpSC101は非常に興味ある対象であると言える。

　2.現在まで多数のプラスミドでイニシエーター蛋白の性質が調べられているが、DNA結合モチーフについて明確にされたものはなく、pSC101のものが初めてである。しかも二量体であるにもかかわらず、pseudo-symmetricな配列を認識するという特徴あるものであった。

　3.グアニジン処理したRepとDNA複合体の挙動からイニシエーターとしてDRに特異的に結合するのは単量体であることが強く示唆された。さらにin vitroにおいてRep単量体の安定化にGroEが関与することを明らかにすることができた。これはGroEがイニシエーターの構造と機能の変換に働くことを示した最初の例であり、二量体から単量体に変換するのではなく単量体を安定化するという点でもユニークである。

　pSC101は他のプラスミドと比較して様々な点でユニークであり、今後さらに研究することでDNA複製開始の分子機構の解明に貢献できるものと信じる。