日本各地から伝統的発酵食品である味噌,醤油,漬物を収集し,食塩存在下でキラー活性を示すキラー酵母を分離した。51点の試料のうち28点から56株のキラー酵母が分離された。そのうち53株はDebaryomyces hanseniiであり,のこり3株はCandida naeodendra,Hansenula anomala,Pichia farinosaと同定された。C.naeodendraとP.farinosaはこれまでキラー酵母としての報告は無く,新規なキラー酵母である。漬物,塩漬け野菜の試料からは76%という高率で主としてD.hanseniiに属するキラー酵母が分離された。味噌,醤油等の試料からは18点中,3点からキラー酵母が分離されたにとどまった。分離したキラー酵母について,既にキラー酵母としての特性で分類されている標準キラー酵母(K1-K10)に対する食塩存在下及び非存在下におけるキラー活性を調べた。その結果,53株のD.hanseniiのキラースペクトルは多様であり,またその多様性は食塩存在下でより増加する傾向が見られた。他の3株も食塩存在下でより多くの酵母に対してキラー活性を示す特徴を持つことが明らかになった。

　味噌麹から分離した新規キラー酵母P.farinosa KK1株の生産するキラー因子は,食塩存在下でより強いキラー活性を示すことから,Salt Mediated KillerよりSMKトキシンと命名し,解析を行った。まず,キラー活性を高感度に検出できるアッセイ法として,マイクロタイタープレートを用いる希釈法を確立した。次いでこのアッセイ法を用いて培養条件の検討を行い,比活性の高い培養濾液を得た。SMKトキシンの安定性を調べた結果,pH4以下で活性は安定に保たれるが,pH4.5以上では安定性が減少し,pH6では完全に失活すること,またキラー活性は温度の上昇と共に減少し,50℃以上では30分間で完全に失活することが明らかとなった。またSMKトキシンはNaCl及びKClの濃度の増加に伴ってキラー活性が上昇することも明らかとなった。

　SMKトキシンの精製は,硫安沈澱,SP-トヨパールによるイオン交換クロマトグラフィー,Butyl-トヨパールによる疎水性クロマトグラフィーにより行った。活性画分の酸性条件でのポリアクリルアミドゲル電気泳動及び低分子ペプチドの分離が可能なトリシンSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)による解析の結果,SMKトキシンはトリシンSDS-PAGE上で4kDaと8kDaを示すとのサブユニットからなる2量体であることが明らかになった。両サブユニット間にはジスルフィド結合は無く,酸性(pH4.5以下)から中性へのpH変化で両サブユニットは容易に解離すること,解離と同時にサブユニットは凝集して沈澱しサブユニットは溶液中に残ることが明らかとなった。一方,酸性溶液中のSMKトキシンのサブユニット間の結合は強く,1.5M食塩存在下あるいは6M尿素存在下でも2量体として挙動した。両サブユニットのアミノ酸組成分析,アミノ酸配列分析の結果から,サブユニットは疎水性アミノ酸に富む約60アミノ酸残基からなるペプチドであること,サブユニットは約75アミノ酸残基からなるペプチドであることが推定された。

　サブユニットから得られたアミノ酸配列を元にプライマーを作製し,P.farinosa KK1株のゲノムDNAを鋳型にしてPCR分析を行った。サブユニットのリジルエンドペプチダーゼ断片の配列をコードする170-bpのPCR断片をプローブに用いて,ゲノムDNAのEcoR I完全消化物をgt11に組み込んだライブラリーのスクリーニングを行った。得られた5.5-kbのEcoR I断片に含まれる1.4-kbのHindIII断片の塩基配列分析を行った結果,222アミノ酸をコードする666-bpのオープンリーディングフレーム(ORF)か見いだされた。サブユニットのN末端配列はORFのGly-146からの配列と完全に一致した。またサブユニットのリジルエンドペプチダーゼ断片の配列から,サブユニットのC末端はORFにコードされる最後のアミノ酸残基Asp-222であることが推定された。このORF上のMet-1からAla-18の配列は典型的なシグナルペプチドの特徴を有していた。続くTrp-19からの配列はサブユニットのN末端アミノ酸配列と一致し,両サブユニットが同一の遺伝子上にコードされていることが判明した。サブユニットのC末端ペプチドのアミノ酸配列分析の結果,C末端アミノ酸はVal-81と同定された。したがって,サブユニットはそれぞれ63及び77アミノ酸残基からなるペプチドであることが明らかになった。ORF上でVal-81に続く2残基はLys-Argの塩基性アミノ酸であり,これは酵母及び高等真核生物で見られるプロセシング酵素Kex2エンドプロテアーゼの認識配列である。サブユニットのC末端がVal-81であることは,SMKトキシンの生成においても,ORFにコードされる前駆体から,Kex2類似酵素による2残基の塩基性アミノ酸のC末端側の切断,続いてKex1類似酵素によるC末端の塩基性アミノ酸の除去,というプロセシングが行われたことを示唆している(図1)。ペプチドと名付けたプロセシングにより切り放されるとの間のSer-84からArg-145の配列には,ORF中で唯一の推定上のN結合型糖鎖の結合位置であるAsn-127が存在する。SHKトキシンとSaccharomyces cerevisiaeのK1トキシンは1次構造上の類似性は無いにもかかわらず,その前駆体構造,疎水性度,プロセシングの様式等において非常に類似していることが明らかになった。

図1.SMKトキシンのプロセシング過程

　ノーザンブロット解析およびプライマー伸長法による解析の結果,SMK1のmRNAは長さが約1-kbであり,5’末端としてnt-218と-311の2カ所が同定された。nt-218の50-bp上流には典型的なTATA boxが存在していた。

　染色体電気泳動の結果,P.farinosa KK1の染色体は少なくとも5本のバンドに分離され,SMK1はその最大のバンドとハイブリッド形成したことからSMK1が染色体上に存在することが確認された。

抗サブユニット抗体に反応する糖タンパク質Gp26の解析

　P.farinosa KK1株を6%食塩を含むYPD培地(1%酵母エキス,2%ポリペプトン,2%グルコース)で培養した培養濾液中には,ウェスタンブロットにより抗サブユニット抗体と反応する約26kDaのタンパク質(Gp26)が存在することが明らかになった。培養条件の検討を行った結果,Gp26の分泌には0.5M以上の食塩を含むYPD培地が必要であり,食塩濃度2-2.5MでGp26の分泌が最大になった。食塩の有無にかかわらずYM培地(0.3%酵母エキス,0.3%麦芽エキス,0.5%ポリペプトン,1%グルコース)あるいは10%の味噌抽出液を含むYM培地ではGp26は分泌されなかった。Gp26の精製は硫安沈澱,SP-トヨパールによるイオン交換クロマトグラフィー,Biofine HIC-PHによる疎水性クロマトグラフィーにより行った。ナタマメの-mannosidase及びEndo--N-acetylglucosaminidase(Endo H)による酵素消化を行った結果,SDS-PAGE上で-mannosidaseでは500程度,Endo Hでは2000程度分子量の減少が見られたことから,Gp26が糖タンパク質であることが確認された。アミノ酸配列分析の結果,Gp26のN末端配列はSMKトキシンのサブユニットのN末端配列と一致した。また,Gp26のリジルエンドペプチダーゼ断片の配列は,サブユニット及びORF上に存在するペプチドの配列と一致した。以上の結果からGp26はSMKトキシンのプロトキシンであることが明らかになった。ノーザンブロット解析の結果,SMK1のmRNAは食塩非存在下でも定常的に転写されていることが示され,食塩により誘導されるGp26の分泌は転写以降の翻訳あるいは分泌経路の過程で制御されていると推定された。