精製にあたり、腎臓は高度に分化した、機能の異なる多種類の細胞から構築される臓器の一つであること、Tamm-Horsfall糖タンパク質、ボドカリキシン、などの機能的に意義づけがなされていないシアロ糖タンパク質を多く産生、発現していることなどをふまえ、精製の出発材料としてウシ腎臓を選択した。

　EDTAを含む緩衝液で調製したウシ腎臓抽出液から、フェツイン-セファロースとヘパリン-セファロースを使ったCa²⁺依存的な二段階アフィニティークロマトグラフィーと、DEAEイオン交換HPLCにより、分子量33kDa(p33)と41kDa(p41)のタンパク質を精製した。p33とp41は、よく類似したアミノ酸組成を持ち、ともにN-末端アミノ酸がブロックされており、またp41はSDS、尿素、熱変性では分子量に変化は見られないが、DTT、2-MEで処理することによりp33に変換された。これらの結果から、p41はp33が還元により切断されうる何らかの修飾を受けたものであることが示唆された。植物レクチン(Con A、WGA、RCA、LCA、UEA-I、PNA)を使ったp33/41の染色結果はすべて陰性であり、p33/41は糖鎖を持たないタンパク質であると考えられた。p33/41に対するウサギポリクローナル抗体でのウシ主要臓器抽出液のイムノブロッテイングの結果から、p33/41は腎臓に限らず肝臓、膵臓、小腸に多く含まれていることが明らかになり、一方、脳、胸腺、甲状腺、筋組織抽出液中にはほとんど検出されなかった。

　p33/41はヒト、ウシ、ウサギ赤血球を凝集しない。そこで凝集試験に変わる簡便なin vitro糖結合活性測定法として、HRPをフェツインおよびヘパリンに標識し、プローブとして用いる固相アッセイ法を開発した。HRPとフェツインは過ヨウ素酸酸化法で、HRPとヘパリンはEEDQを用いてカッブリングし、どちらもゲルろ過で精製後に実験に用いた。p33/41をマイクロタイタープレートに固定化し、HRP-フェツインあるいはHRP-ヘパリンと反応させるとCa²⁺存在下では濃度依存的な結合が認められ、EDTAにより阻害された。この活性を単糖で阻害すると、調べた中ではNeu Acでもっとも強く阻害されたが、100%阻害には200mMを必要とした。またGlcNAc、GalNAcでも高濃度では阻害活性が高かった。これらの結果から、単糖レベルではp33/41の糖結合性を特徴づけられず、p33/41は非還元末端の糖残基のみを認識しているのではなく、さらに広い糖鎖部分が結合に関与していると思われた。糖タンパク質では、シアル酸を含む複合型糖鎖を持つチログロブリン、フェツインで強く阻害され、高マンノース型糖鎖のリボヌクレアーゼBでは弱く、O-グリコシド型糖鎖の顎下腺ムチンでは阻害されなかった。シアル酸を含むN-グリコシド型糖鎖でもトランスフェリンでは阻害されなかった。これはフェツインのN-グリコシド型糖鎖が主に3本鎖であるのに対し、トランスフェリンでは2本鎖であり、p33/41との結合能が弱いこと、また糖含量が低いことが考えられた。HRP-ヘパリンとの結合を酸性多糖で阻害すると、ヘパリン、ヘパラン硫酸、フコイジンで強く阻害されたが、硫酸含量が高くてもキチン硫酸、デキストラン硫酸では阻害されないため、p33/41と糖との結合は、糖鎖上の陰性電荷との相互作用のみではなく、特異的相互作用であることが示唆された。

　p33/41をプロテアーゼ消化し、得られたペプチド断片のアミノ酸配列を調べると、Cタイプレクチンあるいはガレクチンとのホモロジーは見いだされず、既存のレクチンとは異なるタンパク質であることが示唆された。ホモロジー検索の結果、p33/41の部分アミノ酸配列のほとんどがウシアネキシンIVに一致することが明らかになった。アネキシンIVはCa²⁺/リン脂質結合はを共通活性とするアネキシンファミリーに属するタンパク質で、今まで糖結合性に関する報告のなかった分子である。そこでアネキシンIVとの異同を明らかにするために、p33/41のcDNAクローニングを行なった。p33/41の部分配列に基づいて合成した数種のオリゴヌクレオチドをプローブに、ウシ肝臓のcDNAライブラリー(gt10)をスクリーニングした。得られた約1k baseのcDNAのORFには、319個のアミノ酸がコードされ、これは既報のウシアネキシンIVの配列とほぼ同一であった。このクローンのORFをタンパク発現用ベクターpGEX-3Xに挿入し、大腸菌体でグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST、26kDa)との融合タンパク質(GST-p33/41)として発現させた。SDS-電気泳動、イムノブロッティングにより、GST-p33/41は非還元下では分子量57kDaと62kDaの二本鎖として、還元下では57kDaの一本鎖として検出された。GST部分を切断、除去したリコンビナントp33/41は、ネイティブと同様に非還元下で33kDaと41kDaのダブレットとして、還元下で33kDaのシングルバンドとして検出され、p33/41に対するポリクローナル抗体と交差反応することが確認された。このことから、p33とp41は単一の遺伝子から合成されるが、何らかの修飾を受けて酸化型と還元型になり、電気泳動により見かけ上異なるサイズのバンドとして検出されることが明らかになった。GST-p33/41についてフェツイン糖ペプチド-、ヘパリン-セファロースカラムに対する親和性を調べると、Ca²⁺存在下で結合し、EDTAにより溶出され、一方、アシアロフェツイン糖ペプチドカラムには結合しなかった。これらの結果から、p33/41はアネキシンIVと同一であると結論づけた。

　ウシ腎臓のホルマリン固定切片をp33/41に対するポリクローナル抗体を使って免疫組織化学的に染色すると、腎臓の近位尿細管とネフロンの終末部である乳頭管が強く染色された。近位尿細管上皮では細胞の頂端部側の刷子縁膜のみが強く染色され、高度に極性化した近位尿細管上皮細胞におけるp33/41の頂端部側への選択的な輸送、濃縮を示唆していた。このことは、ウシ腎臓ホモジネートから調製した刷子縁膜小胞に、ホモジネートと比較して高濃度にp33/41が濃縮されていた結果からも確認された。一方、近位尿細管での極性化した局在とは異なり、乳頭管上皮では細胞質が一様に染色された。

　ウシ腎臓よりCa²⁺存在下でシアル酸を含む糖鎖や硫酸化多糖に結合するタンパク質p33/41を精製した。p33/41のcDNAクローニング、リコンビナントp33/41の免疫交差反応性とCa²⁺存在下の糖結合活性から、p33/41はアネキシンIVと同一のタンパク質であることが明らかになった。アネキシンは動物及び植物組織中に広く見いだされるCa²⁺/リン脂質結合性のタンパク群で、現在までにアネキシンI〜XIIIまでが同定されている。エキソサイトーシス、エンドサイトーシスに関与する分子であること、イオンチャネルの形成、in vitroでの抗炎症作用、抗凝固作用など様々な活性がアネキシンには見いだされているがその機構は不明である。本研究では、アネキシンが「糖鎖を認識しうる分子」であることを示した。アネキシンが関与する生命現象が、糖とタンパク質の相互作用によって説明づけられる可能性が示唆された。