単離色素体核の基本的な機能解析は、根本ら(1988)の方法に従ってタバコ(Nicotiana tabacum L.)培養細胞BY-2から単離した原色素体核を用いて行った。単離原色素体核は、DAPI蛍光顕微鏡観察によりコンパクトな蛍光スポットとして、また電子顕微鏡観察によりヌクレオソーム様のビーズ構造が三次元的に折り畳まれた構造として観察され、in vivoにおける高次構造を保持していることがわかる(図1、図3)。

　このような高次構造を保持した単離色素体核は、単離色素体とほぼ同等の[³H]UTP取り込み活性を示した(表1)。各種阻害剤や外来の鋳型DNAに対する反応等から、この取り込み活性は単離色素体核に内在する色素体RNAポリメラーゼによる転写産物伸長反応であると考えられる。単離色素体核由来のin vitro転写産物をプローブとするサザンハイプリダイゼーションの結果、in vitro転写産物は色素体DNAに相補的であり、その構成はin vivoにおいて蓄積している色素体転写産物の構成と類似していることが明らかになった。

　DNA合成機能についても同様の解析を行い、単離色素体核がかなり高い[³H]dCTP取り込み活性を示すことがわかった(表1)。反応の至適条件、阻害剤に対する応答、ゲル内アッセイ法によるポリメラーゼの分子量同定、反応産物の解析(図2)などから、この取り込み活性は色素体のDNAポリメラーゼによる色素体DNAの合成反応であることが明らかになった。また、単離色素体核は内在性のDNase活性をほとんど持たず、in vitroでの転写・DNA合成活性の測定に適していることがわかった。

　従来、色素体からはTranscriptionally Active Chromosome(TAC)と呼ばれるDNA-タンパク質複合体が単離されていた。単離色素体核の持つ高次構造、転写およびDNA合成能の保持という特徴をより明確にするために、TACと単離色素体核の形態・機能を比較した。TACは、単離色素体を1% Triton X-100で可溶化し、セファロースカラムを用いたゲルろ過を行うことにより単離される。DAPI蛍光顕微鏡観察すると、単離色素体核がコンパクトな蛍光スポットとして観察されるのに対して、TACは核構造が分散している(図3)。TACの単位DNA当たりの転写活性は単離色素体核の約20%、DNA合成活性は2%と極めて低かった(表1)。このように、単離色素体核は従来法で単離される色素体DNA-タンパク質複合体、TACに比べ高次構造が保持されており、転写・DNA合成活性も高く、in vivoにおける色素体ゲノムの機能を保持している可能性が高い。

　そこで、単離色素体核がin vivoにおける色素体ゲノムの機能を保持しているかどうかを調べるために、単離色素体核のin vitro転写・DNA合成系が色素体分化にともなう色素体ゲノムの機能変化を再現できるかどうか調べた。色素体分化の基本として原色素体、葉緑体およびアミロプラストの三型を解析対象に選び、in vivoでの色素体ゲノムの転写・複製機能の変化をサザン/ノーザン解析等により推定し、単離色素体核のin vitro転写・DNA合成活性の変化と比較した。以下に、それぞれの解析結果を順次述べる。

　タバコ培養細胞BY-2は、通常の培養条件では原色素体を持つ。定常期にあるBY-2細胞を新鮮培地に植え継ぐと、細胞は数時間のラグの後対数増殖期に入り、4-5日目には再び定常期に入る。この過程における色素体核の形態変化をDAPI蛍光顕微鏡観察すると、植え継ぎ後24時間で色素体核のDNA含量が約7倍に増加することが認められる。これは、植え継ぎ直後に色素体DNAの合成が活性化されることを示唆している。そこで、定量サザンハイプリダイゼーションにより色素体DNAの増加曲線を描き、それを基に単位色素体DNA当たりの色素体DNAの増加速度の変化を求めた。色素体DNAの増加速度は植え継ぎ後24時間以内に約6倍に増大した後急速に低下し、定常期にはいると逆に色素体DNAの分解が起こることが明らかになった。色素体転写産物に関しては、顕著な変化は見られなかった。一方、培養過程を追って経時的に単離した色素体核の転写・DNA合成活性の変化を調べると、DNA合成は植え継ぎ後24時間以内に約5倍の活性化を示したが、転写活性は培養過程を通じてほぼ一定で(図4)、in vitro転写産物の構成にも顕著な変化はなかった。これらの結果は、BY-2の培養過程では色素体ゲノムの一過的な複製活性の増大と定常的な転写が起こっていること、単離色素体核を用いたin vitroアッセイ系はこうした変化を反映することを示している。

　タバコ成熟葉の葉肉細胞の葉緑体と、タバコ培養細胞BY-2の原色素体における色素体ゲノムの機能を比較解析した。葉肉細胞の細胞当たりの色素体DNAコピー数は培養細胞の約5倍であったが、成熟葉の葉肉細胞では色素体ゲノムの複製はすでに不活発であると考えられる。9種類の代表的な色素体遺伝子(表2)についてノーザン解析を行い、一定量の色素体DNAあたりの転写産物量を比較すると、RuBisCOや光合成電子伝達系タンパク質、rRNA遺伝子の転写産物は葉肉細胞の方が4-100倍多く、ATP合成酵素複合体タンパク質遺伝子群はほぼ同量、RNAポリメラーゼやリポソームタンパク質の遺伝子の転写産物量は培養細胞の方が多いことが分かった(図6参照)。単離葉緑体核のDNA合成活性は植え継ぎ1日目の原色素体核の35%と低く、あまりDNA合成を行わない時期の原色素体核の活性とほぼ等しい(図5)。単離葉緑体核のin vitro転写活性は、単離原色素体核の約20倍と極めて高い(図5)が、葉緑体分化にともなう転写の活性化の程度は遺伝子ごとに異なっている(図6参照)。個々の遺伝子について、葉緑体と原色素体におけるin vitro転写活性の比と転写産物量の比を調べたところ、両者の間には相関が見られた(図6)。以上の結果は、単離色素体核のin vitro転写活性の変化がin vivoにおける色素体ゲノムの転写機能の変化を反映していることを示すと同時に、色素体転写産物量の調節に転写活性の制御が重要であることを示唆している。

図表図1.単離原色素体核の全載ネガティプ染色法による電子顕微鏡像。a:全景、b:一部の拡大。ビーズ状の構造がみられる。バーは0.1m。 / 図2.単離色素体核のin vitro DNA合成産物とポリメラーゼの解析。 A:反応産物の解析。単離色素体核に[-³²P]dCTP存在下でDNA合成反応を行わせた。反応後DNAを制限酵素HindIUで切断、アガロースゲル電気泳動後、(a)EB染色、(b)オートラジオグラフィーを行った。何れも色素体DNAに特徴的なバンドバターンを示す。 B:ポリメラーゼの解析。単離原色素体核タンパク質を変性サケ精子DNAを含むSDSポリアクリルアミドで電気泳動後renatureし、[-³²P]dCTP存在下、ゲル内でDNA合成反応を行わせた。(a)CBB染色、(b)単離色素体核中のDNAポリメラーゼの活性バンド(116 kDa)、(c)Klenowフラグメントの活性バンド(76 kDa)。 / 図3.単離色素体核とTACの形態比較。(a)プロトプラスト内部における色素体核、(b)単離色素体核、(c)TACのDAPI蛍光顕微鏡像。色素体核はコンパクトな蛍光スポットとして観察されるのに対し、TACでは構造が拡散している。CN;細胞核、バーは1m。 / 図4.タバコ培養細胞BY-2の培養過程における単離色素体核の機能変化。 新鮮培地に植え継ぎ後経時的に色素体核を単離し、in vitroにおけるDNA合成および転写活性を調べた。横軸は植え継ぎ後の時間、縦軸は単位DNA当たりの転写・DNA合成活性を、植え継ぎ時の活性を1とする相対値で示す。DNA合成は植え継ぎ直後に活性化される。転写活性は培養過程を通じてほぼ一定である。異なるシンボルはそれぞれ独立の実験を示す。 / 図5.単離葉緑体核と単離原色素体核のDNA合成および転写活性の比較。タバコ植物体成熟葉から単離した葉縁体核と植え継ぎ後1日目の培養細胞BY-2から単離した原色素体核のDNA合成および転写活性を比較した。横軸は反応時間、縦軸は単位DNAあたり、高分子画分に取り込まれた[³H]dCTPあるいは[³H]UTPの放射能を示す。■は原色素体核、●は葉緑体核。 / 表1.単離色素体、単離色素体核、TACのin vitro転写・DNA合成活性の比較 一定量の色素体DNAあたり26℃、1時間の反応で高分子画分に取り込まれる[³H]UTPまたは[³H]dCTPの放射能を測定した。数値は単離色素体核の転写・DNA合成活性をそれぞれ100としたときの相対値。

　タバコ培養細胞BY-2において原色素体からアミロプラストへの分化を誘導する実験系を開発し(図7)、分化にともなう色素体ゲノムの機能変化と単離色素体核の機能変化の関係を経時的に解析した。定常期のBY-2細胞を、オーキシン(2、4-D)を含まずサイトカイニン(BA)を添加した改変培地に植え継ぐと、細胞はほとんど分裂・増殖せず、色素体は大量のデンプンを蓄積して48時間以内にアミロプラスト化する。この過程では細胞当たりの色素体数、色素体DNAコピー数もほぼ一定であり(図8)、色素体のDNA合成・分裂増殖は活性化されない。色素体DNA当たりの色素体転写産物蓄積量の変化を調べると、psbA(光化学系II反応中心32kDaタンパク質遺伝子)とpsaA/B(光化学系I反応中心P700アポタンパク質A1/A2遺伝子)転写産物は培養過程を通じて増加を続け、他の多くの転写産物は培養のごく初期に蓄積量が増大した後、増加を停止することがわかった。これは、アミロプラスト分化過程においてpsbA,psaA/B両遺伝子の転写活性が相対的に高く保たれることを示唆している。アミロプラスト分化誘導過程では、単離色素体核のDNA合成活性は顕著な活性上昇を示さなかった。一方、単離色素体核のin vitro転写活性は24時間で植え継ぎ時の30%にまで急速に低下する(図9)。in vitro転写産物をプローブとするハイブリダイゼーションにより個々の色素体遺伝子の転写活性の変化を調べると、psbAとpsaA/Bの転写活性は24時間目でもそれぞれ植え継ぎ時の33%および14%に保たれているのに対し、他の遺伝子の転写活性は4%以下に低下していた(図10)。これらの結果は、アミロプラスト分化過程では色素体ゲノムの複製は活性化されず、転写活性も低下するが、psbAなど一部の遺伝子は転写活性が比較的高く保持されることを示している。このようなアミロプラスト分化過程における色素体ゲノムの機能変化は、本研究により初めて明らかになった。今後は、こうした色素体ゲノムの機能変化の制御機構を色素体核の構造との関連を念頭におきつつ詳細に解析して行きたい。

図表図6.葉緑体と原色素体における色素体遺伝子のin vitro転写活性比と転写産物蓄積量比の関係。 図中に示した9種類の色素体遺伝子について、横軸に単離色素体核のin vitro転写活性の比(CPN/PPN)を、縦軸に転写産物蓄積量の比(CP/PP)をプロットした。rpl16遺伝子を除いて、葉緑体分化にともなう転写の活性化と転写産物蓄積量の増加の間に相関がある。遺伝子名は表2参照。 / 図7.タバコ培養細胞BY-2におけるアミロプラスト分化の誘導。A;誘導系の模式図。定常期にある細胞(左)を通常培地に植え継ぐと色素体は未分化な原色素体の状態を保つ(上)。2,4-Dを含まずBAを含む改変培地に植え継ぐとアミロプラストの形成が誘導される(下)。B;通常培地(+2,4-D)および改変培地(+BA)における細胞数(●)と細胞当たりのデンプン含量(○)の時間変化。改変培地では細胞は増殖せず、デンプンを蓄積する。 / 図8.アミロプラスト分化過程における色素体DNAレベルの変化。アミロプラスト分化誘導培地に植え継ぎ後、経時的に全細胞DNAを抽出し制限酵素HindIIIで切断、電気泳動後、(a)細胞核rRNA遺伝子および(b)色素体psaA/B遺伝子をプローブとするサザンハイプリダイゼーションを行ない、細胞核および色素体のDNA量の変化を調べた。(c)は細胞当たりの色素体DNAレベルの経時変化。横軸は植え継ぎ後の時間、縦軸は色素体DNAレベルを植え継ぎ時を100%とする相対値で示す。垂直のバーは標準偏差。 / 図9.アミロプラスト分化過程における単離色素体核の転写活性の変化。横軸は植え継ぎ後の時間、縦軸は単離色素体核の単位DNA当たりの転写活性を、植え継ぎ時を100%とする相対値で示す。垂直のバーは標準偏差。 / 図10.アミロプラスト分化過程における色素体遺伝子の転写活性の変化。アミロプラスト分化誘導培地に植え継ぎ後、0,6,12,24,48時間目の細胞から色素体核を単離し、DNA量を揃えた後、[-³²P]UTP存在下でin vitro転写反応を行わせ、³²P-転写産物を色素体遺伝子プローブのセットに対してハイブリダイズした。A;オートラジオグラム。各列の下の数字は植え継ぎ後の時間。左の遺伝子名はプロットしてあるプローブを示す。B;各遺伝子の転写活性の経時変化。横軸は植え継ぎ後の時間、縦軸はオートラジオグラムのシグナル強度を、各遺伝子について植え継ぎ時の値を100%とする相対値で示している。 / 表2.本研究で解析に用いた色素体遺伝子