沈殿剤として硫安や塩化カリウム、ポリエチレングリコールなどを用い、塩基性から酸性に至るまで様々な条件を試してみた。塩基性条件下で得られた結晶(Form I)は、X線解析に適さなかった。表1に示すように酸性条件下で結晶化したとき、少なくとも2.2Aまでの分解能をもつ良好な結晶(Form II)が得られた。この結晶は空間群P212121で、非対称単位中には2分子含まれていた。結晶学的データを表2にまとめた。

図表図1 様々な鳥類の卵黄抽出物のSDSページとニワトリVMO-Iに対する抗体を用いたウエスタンブロットの結果 / 図2 CDスペクトル / 表1 良好な結晶(FormII)が得られた結晶化条件 / 表2 Form I,IIの結晶学的データ

　VMO-Iの初期構造を得るための位相は重原子同型置換法(MIR)により決定した。約60種類の重原子試薬を浸漬時間や濃度を変えて、計数百条件を試してみた。VMO-IにはフリーのCysやMetが含まれていないことも一因となって重原子探索は難航し、多くの試薬は強度変化を示さなかったり、或いは強い非同型性を示した。最終的にオスミウム、白金、水銀の3種類の重原子誘導体を用いた。重原子パラメータを精密化して初期位相を決定した。しかし各重原子誘導体とも重原子の占有率が低く同型性も良好ではなかった。それ故、位相決定力が低くなり、得られた電子密度図のS/N比も低く、主鎖を示す電子密度が多くの場所でとぎれておりペプチド鎖を追うことは不可能であった。解釈可能な電子密度図を得るためにはより良好な重原子誘導体が必要であったが、多くの条件・試薬を試し尽くしており、これ以上の重原子探索は断念せざるを得なかった。

　そこで本研究者は電子密度の側から計算的に位相を改善していく方法、位相改善法を適用することにした。これにより質の悪い電子密度でも解釈可能になる場合があるからである。しかし必ずしも成功するわけではなく、適用しても解析が成功に至らない場合も多い。本研究では位相改善法として、溶媒平滑化、重原子パラメータの再精密化、分子平均化という三方法を用いた。前二法の適用で電子密度図は徐々に改善されていったものの、依然としてペプチド鎖を追うことは不可能であった。最後に分子平均化法の適用によって電子密度図が飛躍的に改善され、ペプチド鎖を追うことが可能となった。

　分子平均化した電子密度図上でCaと思われる位置に原子を置いていき、電子密度表示とモデル構築のためのプログラムOによってCaから主鎖、側鎖を発生させ一分子のモデルを作り出した。この後、重原子位置より求めた非結晶学的な位置関係に基づいて非対称単位中の独立な二分子のモデルを発生させた。

　このモデルをもとに分子動力学法による精密化プログラムX-PLORを用いて、構造の精密化を行なった。最終的に6.0-2.2Aの強度データに対しR因子は18.8%となった。

　VMO-I分子のぺプチド鎖の流れを図3-(a)に模式的に示す。VMO-Iは3つの類似した構造単位から構成されていた。各構造単位を約120°回転させるとよく重なりあうことから(図3-(b))、一次構造上の3回の繰り返し構造に対応して、三次構造も相同な3つの構造から構成され、しかもそれらがほぼ完全な分子内三回回転軸の周りに配置していることが判明した。各構造単位のトポロジーがよくわかるように表わしたのが図3-(c)である。各構造単位は-sheetを含み、すべての-sheetはGreek key motifを有するので各単位をGreek key構造と呼ぶことにする。

　さらに、立体構造上の3つの繰り返し単位を一次構造に表わしたものを図3-(d)に示す。最初提唱されていた並べ方とは異なり、N末側とC末側で1つのGreek key構造が構成されていた。3つのGreek key構造間には若干の構造の違いがある。一番目は2つの長い-strandと3つの短い-strandからなる-sheetであったが、二番目は短い-strandを1つ欠いている。代りにその対応する領域ではセリン残基の側鎖が隣の-strandと水素結合を作っている。三番目はN末からの3つの短い-strandとC末からの2つの長い-strandから構成されている。

　また、図3-(a)からわかるように3つの-sheetはプリズムのような三角柱側面の壁を形成し、この壁によって囲まれた分子内部は疎水性残基で埋められている。分子の上部と下部にはGreek key構造間にそれぞれ3対の水素結合が存在し(図3-(e))、さらに分子下部には各-sheetを結び付けているS-S結合が存在して分子骨格を安定化している。

図3 VMO-Iの立体構造とフォールディング

　基質結合部位としては、分子上部に存在する長い-strandを結ぶ3本のループで囲まれたくぼみが考えられた(図4)。他にはVMO-Iにくぼみは存在しない。このくぼみは、ループの付け根付近にあるAsp,Gluに起因して、静電ポテンシャルが負の環境になっている(図4)。

　このくぼみを基質結合部位として、基質であるN-アセチルグルコサミン(NAG5)とのドッキングスタディを行い、VMO-I分子との安定な複合体構造を推定してみた。エネルギー計算から得られた最も安定な複合体構造を図5に示す。リゾチームにおいてはAsp,Gluが触媒基であり、さらにTrpが基質の結合に重要であることがわかっている。VMO-IとNAG5の複合体構造においても、基質の切断箇所である4番目と5番目の糖との間に触媒基候補であるGlu,Aspが向かい合い、2番目の糖の付近にTrpが配置していた。IMO-Iがリゾチームと一次構造上の相同性はなく、フォールディングも完全に異なるにもかかわらず、リゾチームで活性に関与するアミノ酸残基が立体的に似た配置でVMO-Iに見い出されたのは興味深い。

　蛋白質の密な球状構造部分はドメインと呼ばれ、ドメイン構造には主として,/,の3つがある。各ドメイン構造は、二次構造の組合わせ方から様々なファミリーに分類される。構造解析された蛋白質の数が増えている割には、ファミリーの数はそれほど増えておらず、現在までに百数十種類程しか知られていない。このことは新しいファミリーの発見の難しさを物語っている。

　本研究の成果の重要な点の一つはVMO-Iが新しいファミリーに属することがわかったことである。この発見をもとに調べたところ、既に解析されていた昆虫毒素である-endotoxinの二番目のドメインが共通のfolding topologyを有しており(図6)、同じファミリーを形成していることが判明した。このファミリーは-prismと名付けられた。この2つの蛋白質のフォールディングを比べると、図7に示す通り-endotoxinでは-helixが存在し、その結果、分子内部の三回軸がVMO-Iの方がずっと明瞭であるなどの相違点がみられたが、Greek key motifをとっていることなど、両者の間には確かに構造的な類似性が存在している。

図表図4 基質結合部位と推定されるくぼみ / 図5 VMO-Iと基質(NAG5)の最安定複合体構造 / 図6 VMO-Iと-endotoxin domain IIのトポロジーダイアグラム図 / 図7 VMO-Iと-endotoxin domain IIのリボンモデルを重ね合わせた図(断面)

　-prismファミリーはこれから様々な蛋白質で見い出される可能性がある。